[发明专利]罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；

（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；

（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；

NASBA扩增：

（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U  T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH；

引物MrNV-P1F序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-P1R序列见SEQ ID NO：2，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：3；

（6）在16-21μL预反应液中加入4-9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25μL，然后在40℃-42℃下反应60-120min；

LFD试纸检测：

（7）取步骤（6）所得NASBA扩增产物5-10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50-100μL缓冲液，5-15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。

2.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA。

3.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法，其特征在于：引物MrNV-P1F为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。

6.一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括NASBA扩增反应液，16-21μL的NASBA扩增反应液包括： 0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R， 0.1-0.2μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的 pH8.0-8.5Tris-HCl， 20-50mmol/L 氯化钾， 10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，10%-15% DMSO，1-2mmol/L dNTP，2-4mmol/L NTP，0.1-0.2μg/μL BSA，10-20U RNase 抑制剂，2-6U逆转录酶AMV，20-40U  T7 RNA 聚合酶，0.1-0.3U RNaseH；

引物MrNV-P1F序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-P1R序列见SEQ ID NO：2，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：3。