[发明专利]一种制备高活力胰酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备高活力胰酶的方法，以保证所制备的胰酶有较高的收率和活性。  

背景技术

动物胰脏素有“酶库”之称，因其含有多种酶，如蛋白水解酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶等）、胰脂肪酶、弹性蛋白酶等。胰酶是我国及国际上多国药典收载的助消化药品，用于治疗消化不良及肝脏疾病引起的消化障碍等^[1]。除此之外，胰酶还作为生物酶应用于科学研究。同时，胰酶还多应用于皮革加工、丝绸、纺织、印染等工业部门^[2]。 

我国对动物胰脏中提取制备胰酶的研究在上世纪80年代及90年代较多。目前，有关胰酶的制备多采用低浓度有机溶剂（如25%乙醇、10%丙酮、7.5%异丙醇等）提取，然后用高浓度有机溶剂沉淀，各工艺所生产的胰酶中三酶（胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶）活力差异较大，还没有胰酶三酶活力都相对较高的工艺，尤其是胰脂肪酶的活力最容易受到有机溶剂及蛋白酶的破坏，因而通过采用温和的提取及沉淀方式，并添加合适的保护剂来提高各酶活力是优化胰酶生产工艺的一项重要措施。现已有使用壳聚糖替代有机溶剂作为沉淀剂的研究^[3,4]。还有研究者将胰脏用CaCl₂水溶液活化后，用PEG6000进行沉淀，所得胰酶各酶活性有所提高^[5,6]。 

除了采用温和的沉淀方法来提高蛋白质产物的收率和活性外，也可以在提取过程中添加合适的保护剂来为目标蛋白提供适宜的存在环境。目前有研究者在提取胰酶的过程中加入保护剂麦芽糖、淀粉、甘油、氯化钠等^[7,8,9]。 

糖类作为蛋白保护剂应用已久，其保护作用与它们的化学结构有密切关系。它们通常具有5个以上的羟基，可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护的目的。常用作保护剂的糖类单糖主要有葡萄糖，双糖有蔗糖、海藻糖、乳糖，聚糖有葡聚糖。它们有一个共同的特点就是具有大量的自由羟基， 其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。糖的还原性越弱，对蛋白质的稳定保护作用也越强。 

表面活性剂如吐温80等，在临界胶束浓度附近，对蛋白质有稳定和保护作用^[10]。 

本发明在目前胰酶制备工艺基础上从生产猪胰岛素的胰渣中提取制备胰酶，由于胰酶中各有效成分是溶于水的，因此用水作为提取溶媒安全环保，成本低，制得酶活力高，提取溶媒也可多次回收利用。本发明通过避开有机溶剂的大量使用及添加适宜的保护剂等措施，制备高活力的胰酶。 

发明内容

本发明的目的是提供一种在胰酶生产过程中能较大限度地保存各酶的活性同时提高胰酶收率的方法。 

本发明在制备胰酶的活化液中加入2%CaCl₂ 溶液，并添加NH₄Cl、NaCl、蔗糖、淀粉、甘油及吐温80，Na₂HPO₄调pH为5.5～7.0，30℃活化6h，加入沉淀剂PEG-6000搅拌30min，4℃冰箱放置1 h，离心，沉淀用两倍体积冷丙酮脱脂两次，乙醚脱脂一次，干燥得胰酶。本发明所加的NH₄Cl、NaCl 、Na₂HPO₄等盐可以使胰酶生产环境维持一定的离子强度，适于蛋白质活性的保存。NH₄Cl对胰脂肪酶的活性有一定的激动作用，可以提高其活性。蔗糖、淀粉、甘油等对酶等蛋白质都有一定的保护作用，甘油和吐温80对胰脂肪酶的保护作用比较明显，而在生产胰酶的过程中，胰脂肪酶的活性最易损失。通过加入本发明所述的上述保护剂，所制得的胰酶重量回收率为12%左右，三酶活力分别为胰蛋白酶5.40 U/mg、胰脂肪酶39.73 U/mg、胰淀粉酶76.72 U/mg，三酶活力比为1:7.4:14.2，接近天然比例。 

本发明的特征是在活化液中所加的保护剂的组合为0.5%NH₄Cl、0.5%NaCl、1%蔗糖、0.2%淀粉、1%甘油及0.5%吐温80，经4molL^-1的Na₂HPO₄溶液调pH值为5.5～7.0。 

本发明中胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的活力测定方法参照欧洲药典6.0版。