[发明专利]异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一株高效异源表达米黑根毛霉脂肪酶的菌株。 

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3）是一类能够水解三酰甘油的酶，因其可以催化水解、酯化、转酯化、氨解以及酯类的逆向合成等多种反应，因而可以应用在食品、医药、化妆品、生物柴油等生产、生活中的很多方面。被称为第三大工业用酶。 

酶法与化学法相比，因其反应条件温和、副产物少以及具有环境友好性等特点，将逐步代替高能耗高污染的化学法。 

脂肪酶的应用主要包括，在食品工业中通过应用脂肪酶分解油脂释放出的短链脂肪酸及单甘脂来改进食品的风味、香味与质构，达到食品增香的目的；乳品工业中，脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸，能赋予奶制品独特的风味；作为洗涤剂的添加剂：利用脂肪酶可以水解脂肪的能力，在洗衣粉配方中加入适量的碱性脂肪酶，并与碱性蛋白酶配伍成复合酶，不仅可以明显提高洗衣粉的去污力，而且对洗涤织物的保养，抗再污染等方面有显著效果；在造纸工业中：脂肪酶以除去纸浆中的“洽脂”于改善纸的加工过程；在皮革加工过程中，利用脂肪酶对脂肪作用或与蛋白酶混合使用，将皮革或皮毛紧密相连的残余脂肪和蛋白脱除，其脱脂效果可明显提高皮革的质量。目前有越来越多的微生物来源的脂肪酶被开发出来，因为其性质的不同而在不同领域中发挥着重大的作用。 

米黑根毛霉脂肪酶是一种1,3-位置专一性的脂肪酶，作用于三酰甘油的1位和3位酯键。在工业上也有十分广泛的应用，由于其特异 性比较强，可以与单双酰脂肪酶组合用于生物柴油的制备，效果很好。 

虽然在前期研究证明该酶具有特异性并已尝试应用到生物柴油的制备中，但由于酶活不高，导致该酶成本过高，限制了其应用。因此建立高效分泌表达体系，提高酶活水平，是亟待解决的问题。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种高效异源表达米黑根毛霉脂肪酶的重组毕赤酵母以及其制备脂肪酶的方法。 

本发明的另一个目的是提供一种可在上述毕赤酵母中分泌表达该脂肪酶的表达载体。 

本发明的再一个目的是上述方法制备的米黑根毛霉脂肪酶在水解三酰甘油及生物柴油制备中的应用。 

为实现以上目的，本发明首先提供了一种米黑根毛霉脂肪酶（Pro-RML），其的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明从米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）菌株中克隆到包含前导肽的1,3-位置专一性的脂肪酶（Pro-RML）基因pro-rml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为（1017）bp，分析表明，GC含量为（48.9）%，编码（339）个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小45—66kDa，等电点预测为4.89（http://web.expasy.org/compute_pi/），活性中心是214位Ser,327位His,273位Asp。实验表明由该基因编码的脂肪酶具有较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH值为6.0，在pH5～10条件下稳定。为便于表述，将该脂肪酶命名为Pro-RML。 

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的含自身前导肽的米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列（SEQ ID No.2），在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第（25）位的（Pro）替换为（Ala）。 因此，本发明含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Pro-RML同等活性的由Pro-RML衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。 

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Pro-RML的核苷酸序列。 

将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明Pro-RML的基因工程菌。 

上述重组载体转化的宿主细胞优选为巴斯德毕赤酵母X-33。