[发明专利]用于鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列、试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，开发出一种能够快速鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列、试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

瓜类枯萎病是一种世界性土传维管束病害，对瓜类的产量和品质构成严重威胁，连作地块的损失率达到30%以上，严重地块甚至绝收。瓜类枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的，根据瓜类上不同的寄主可以将尖孢镰刀菌划分为7个专化型。该病菌在土壤和植物残体上可长期存活，并且植株的整个生育期均可发生，一旦发病就难以根除，化学药剂的施用也难以达到控制病害的效果。随着保护地瓜类生产的快速发展，瓜类根腐病也逐渐上升为主要病害之一，对瓜类的产量和质量造成了极为不利的影响。根腐病发生早、蔓延快、为害大、损失重，保护地的平均发病率为15%，高的达到72%，损失率达20%以上。瓜类根腐病的主要致病菌是茄病镰刀菌（Fusarium solani）,该病从始花期开始发病，为害植物根部，造成根部皮层腐烂，上部茎叶萎蔫死亡。

由于瓜类根腐病的发病症状特征与枯萎病极为相似，并且引起病害的主要致病菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）又同属于镰刀菌属。迄今为止，基于镰刀菌形态学方面的分类鉴定方法很难适用于极易发生突变的镰刀菌，操作复杂并且鉴定准确度低，很容易造成误诊，贻误防治时机、影响防治效果。

随着分子生物学技术的不断发展，镰刀菌属的鉴定工作也引入了分子系统学方法，常用于鉴定该属系统学研究的主要DNA序列包括：核糖体内转录间隔区ITS、β微管蛋白等。而茄病镰刀菌（Fusarium solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的ITS、β微管蛋白等序列的相似度极高，利用这些基因的多位点序列设计的鉴定引物无法区分这两种病原菌。因此，需要找到能够区分这两种病原菌的基因序列，建立一套新的分子生物学鉴定体系，能够快速、准确地鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌，该体系的建立将对瓜类根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。

已有的专利号为201010567807.5的中国专利技术报道《一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法及试剂盒》，该发明根据克隆测序的尖孢镰刀菌ITS区序列设计出特异性引物Fo1/Fo2。然而镰刀菌真菌由于种间rDNA-ITS序列相似性较高，仅以ITS区做为靶序列设计引物，有可能无法将其与同属中的其它种分开。且利用Fo1/Fo2引物并未检测到本发明中样品FO-2的尖孢镰刀菌DNA，即该引物不能鉴定所有的尖孢镰刀菌。另外，赤霉菌属分类上的许多镰刀菌种并没有ITS2同源基因，因此以ITS区为靶标序列用于区分镰刀菌种容易得出错误的系统发育推断。另一专利号为201110444010.0的中国专利技术报道《尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物》，该发明分析比较了尖孢镰刀菌（F.oxysporum）与其它病原真菌的CYP51C序列，设计出对尖孢镰刀菌基因组DNA有高度特异性的引物。但是CYP51基因在不同真菌中的同源基因的数量不同，多数病原真菌的CYP51的同源基因为1-2个，只有尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌等有3个CYP51同源基因，因此以有多个同源基因的CYP51序列为靶标基因可能造成鉴定失败。利用C1/C2该对引物并未检测到本发明中样品FO-X的尖孢镰刀菌DNA，即该引物不能鉴定所有的尖孢镰刀菌。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是提供鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列，该组引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类根腐病和枯萎病进行早期预警和防治。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的试剂盒，该试剂盒内引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类根腐病和枯萎病进行早期预警和防治。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供相关的鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的方法。

本发明解决上述首要技术问题的技术方案是：一种用于鉴定茄病镰刀菌的引物序列，其特征在于：上游引物具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO:2所述的碱基序列。

一种用于鉴定尖孢镰刀菌的引物序列，其特征在于：上游引物具有序列表中SEQ ID NO:3所述的碱基序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO:2所述的碱基序列。