[发明专利]一种牛乳源金黄色葡萄球菌Efb蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和免疫技术领域，具体内容是乳腺炎牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的Efb蛋白及其编码氨基酸序列，涉及牛乳源金黄色葡萄球菌来源的Efb蛋白的制备方法和其在免疫中的可能应用。

技术背景

近年来我国奶牛业因患奶牛乳房炎而导致我国畜牧业遭受严重的经济损失。据报道，国外奶牛乳房炎的发病率约为25％～60％，在我国奶牛乳房炎的阳性率为46.4％～86.7％，奶牛临床型和隐性乳房炎的发病率均高于国外。这也是我国奶牛产奶量低，牛奶质量差的主要原因之一。而金黄色葡萄球菌是牛乳房炎的主要病原，近50％的乳房炎是由该菌引起的。由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎已严重影响了我国奶牛业和乳品工业的发展，并危害到人类的健康。

奶牛乳房炎是全球性多发的疾病，一旦感染奶牛便不好根治，能够引起奶牛产乳量下降及乳制品质量下降，导致畜牧业经济严重受损。自从20世纪40年代抗生素问世以来，抗生素一直是控制奶牛乳房炎的基本药物。对无乳链球菌，大肠杆菌引起的乳房炎有很好的疗效。尽管目前抗生素治疗仍然是控制奶牛乳房炎的主要手段，但人们也意识到单靠抗生素并不能从根本上解决奶牛乳房炎问题。

疫苗被认为是预防和治疗奶牛乳房炎最有效的策略。目前研究表明，Efb是由金黄色葡萄球菌分泌到菌体外的一种大小为15.6KDa细胞外纤维蛋白原结合蛋白，为金黄色葡萄球菌表达的唯一抑制血小板聚集的蛋白。Efb是最先发现其与纤维蛋白原结合而得名，该基因在目前几乎所有金葡菌分离株中均存在。它能够逃避宿主的多种防御机制，已被证明是一个潜在的毒力因子。据报道，Efb能够与补体C3b结合从而抑制补体激活，与Fg以及血小板受体GPIIb/IIa结合而阻止血小板凝集，并在小鼠伤口感染金黄色葡萄球菌模型中延迟伤口愈合。小鼠乳房炎模型证明接种Efb疫苗可明显减少细菌寄居在乳腺组织的数量。

由于Efb对于宿主天然免疫系统的相互作用，使得Efb蛋白在金黄色葡萄球菌的定植以及感染中发挥着关键作用，Efb是金黄色葡萄球菌一个重要的免疫逃避因子。因此对该蛋白及其基因的研究有助于加深对奶牛乳腺炎发病过程中金黄色葡萄球菌致病性的了解，可为抗该菌的感染提供更为深入的理论基础和新的免疫及治疗靶标。

以往的研究已对金黄色葡萄球菌不同菌株的Efb的核苷酸和氨基酸序列进行了比较与分析(韦海娜，王世民，邵俊高等，牛乳源金黄色葡萄球菌Efb基因的克隆与序列分析，新疆农业大学学报2012，35(6)，469-473)，序列比较分析的结果表明分离的同一地区分离的牛源金黄色葡萄球菌Efb的氨基酸序列同源性为91-100％，不同地区分离的牛源金黄色葡萄球菌不同菌株Efb的氨基酸序列同源性为86-100％，该结果表明金黄色葡萄球菌不同菌株的Efb蛋白的序列可呈现出一定的差异。

尽管目前国内在该蛋白的研究方面有以金葡菌NCTC-8325菌株基因组为模板得到扩增片段大小为393bp，可获得大小为20kd的蛋白该体外重组表达Efb蛋白，该蛋白被验证对补体的激活具有抑制作用(张鑫，高亚萍，董洁等，金黄色葡萄球菌Efb蛋白的表达、纯化及功能抗体的制备，军事医学科学院院刊，2009，6(33)：531-534)，但该蛋白在免疫方面的研究和利用在国内少见报道。基于我们以往的研究结果已经表明牛源金黄色葡萄球菌不同菌株的Efb蛋白的序列呈现出一定的差异。该序列的差异必将影响该蛋白的免疫原性。因此为有效防制由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎，我们对来自于牛乳源金黄色葡萄球菌Efb蛋白进行克隆与表达，进而对其免疫原性进行研究与应用。本发明中我们的出发菌株为牛乳源金黄色葡萄球菌，所扩增得到的基因片段的大小为426bp，与以往研究中以金葡菌NCTC-8325菌株基因组为模板克隆所得到的Efb基因的来源和基因的大小均不同，所表达的蛋白大小也是不同的。

发明目的

针对目前新疆地区奶牛养殖业对牛乳腺炎疫苗的研究的需要，本发明分离的新疆地区乳腺炎牛乳中的金黄色葡萄球菌，从该致病菌株基因组中克隆了Efb基因并测定其序列推导出其相应的氨基酸序列。并将隆到原核表达载体pET-28a中获得重组克隆，转化至工程菌BL-21中并对改蛋白进行诱导表达及纯化，利用该蛋白序列有可能制备防治该病感染的亚单位疫苗。

发明内容

(1)Efb基因PCR扩增引物的设计与合成

根据GenBank中已发表的金黄色葡萄球菌Efb基因序列自行设计一对特异性引物，经该引物的扩增应得到426bp的条带。