[发明专利]PON-1活性检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以2-氯对硝基苯磷酸二乙酯为底物的PON-1活性检测试剂盒及其检测方法，适用于生化分析仪体外定量测定人血清等体液中PON-1的活性，作辅助诊断用。

背景技术

心血管疾病，又称为循环系统疾病，主要包括：心脏病、低血压、高血压、高血糖症、中风、心肌梗死、血栓、动脉硬化等，其病理基础是动脉粥样硬化。对于心血管疾病的预防和早期诊断是近年来医学界研究的重点之一。

目前临床上常通过测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、脂蛋白a（Lp-a）、载脂蛋白B100（Apo B100）、载脂蛋白AI（Apo AI）、肌酸激酶（CK）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白（cTnT和cTnI）、α-羟丁酸脱氢酶等的浓度作为评价心血管功能的指标。但是此类方法存在一个明显的缺点：这些指标参数只有在心血管组织严重受损的时候，才能比较客观的反应心血管功能，并且存在误诊的可能性，而在早期心血管疾病中，这些指标不能及时反映心血管功能的微妙变化。心血管疾病的临床表现迟于病理出现，因此当血脂和心肌酶指标明显升高时，心血管组织已经出现了严重的损伤，并且可能发展为冠心病、心肌梗死甚至是死亡。因此，寻找心血管疾病早期诊断标志物并且开发相应的检测试剂及方法就有极其重要的意义了。

对氧磷酶(paraoxonase,PON)是一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶，主要由肝脏分泌，在哺乳动物体内广泛分布于许多组织，如肝脏、血液、肾脏、脾脏及脑组织等。PON分子量为43000～45000道尔顿，主要由肝脏分泌的，它广泛分布于体内各组织中，包括肝脏、血液、脑组织等。PON基因家族至少有3个成员，包括PON-1、PON-2和PON-3。大多数研究表明，各种原因引起的心血管疾病，血清中PON-1的活性会相应降低，其浓度和活性与心脑血管疾病密切相关,是心脑血管疾病的危险因子。可见PON-1对于心血管疾病是一种简便易行并且敏感性较高的指标，因此可以作为各类心血管疾病早期诊断、危险度评估及临床监测的新指标。

目前国内外血清PON测定的方法主要有：比色法、紫外分光光度法、荧光法、放射免疫法、终点显色法、固定时间两点法、连续监测法等等。其中比色法和紫外分光光度法应用最为广泛。

比色法是依据1988年Furlong等人建立的一种以paraoxon为底物来测定血清中PON-1的方法，通过比较或测量空白液及测定液的光密度差值，用摩尔消光系数计算出单位时间内每毫升血清中PON-1将paraoxon转变成产物的量，得出血清PON-1的浓度及活性，是一种经典的、成熟的测定方法，广泛被运用于临床生化实验室中。但是由于paraoxon底物水解释放出的色源接近血清的颜色，测定时会对数据产生影响，需要扣除本底；另一方面，从测量的准确度、灵敏度和应用范围上，比色法都不如紫外分光光度法，该法在测定低活性的PON-1时其误差较大，需通过增加血清样本体积来达到灵敏度上的检测要求。

紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。PON在体内的天然底物尚不清楚，目前各实验室常用对氧磷或乙酸苯酯作底物测定PON活性。乙酸苯酯在PON的催化下生成乙酸和苯酚。根据苯酚对270nm紫外光有强烈吸收而乙酸苯酯吸收极低这一性质，可通过酶促反应后270nm吸光度的增加值来检测PON活性的高低。

荧光法利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法；放射免疫法利用同位素标记，通过观察不同抗原同抗体发生竞争性抑制反应，研究物质在机体内的发展和转化规律；连续监测法通过测定尿样、血样单位时间内吸光度的变化，推断、计算酶活性的变化；显色法利用物质与试剂反应产生的显色反应推断、计算酶的活性。

综合各种方法，各有各的应用条件与对应底物，各有优劣。因此本领域迫切需要一种可以方便普通医务人员使用、易于长期保存、检测精度较高的PON-1活性检测试剂盒及其检测方法。

发明内容

本发明的目的是根据上述现有技术的不足之处，提供一种PON-1活性检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒通过配制甘氨酸-NaOH缓冲液和2-氯对硝基苯磷酸二乙酯底物液，将两者混匀并加入一定量的血清样本，血清样本中的PON-1水解2-氯对硝基苯磷酸二乙酯的磷酸键，游离出色源对硝基酚，通过测定对硝基酚在405nm处吸光度的增加可求得PON-1的活性和浓度。