[发明专利]基于一维长柱液相色谱串联质谱的蛋白质组分离鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及蛋白质组的分离鉴定方法，具体涉及基于一维长柱液相色谱串联质谱的快速高效蛋白质组分离鉴定方法。

背景技术

现有技术公开了蛋白质组学是研究一个基因组表达的所有蛋白质的科学，最早在90年代初期由Marc Wilkins首先提出，其是对蛋白质的大规模研究，包括蛋白质的鉴定，蛋白质翻译后修饰及其相互作用等。已知，蛋白质组学的生物样品组成复杂，在检测之前需要进行分离以减少样品的复杂度，目前常用的方法有十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、 等电聚焦电泳(IEF)、强阴/阳离子交换(SAX/SCX)、反相液相色谱等方法。为了提高鉴定率增加蛋白质的覆盖度，有研究提出了一系列二维分离方法；研究实践中，常采用联用的方法，有SDS-PAGE与RPLC、IEF与RPLC、SAX/SCX与RPLC等，通过不同分离方法之间的联用可提高蛋白质的鉴定量，但是二维的分离方法耗时长，消耗样品量大，操作繁琐；

此外，蛋白质的鉴定是研究蛋白质组学的基础，常用的检测器是质谱，通常质谱离子化装置包括基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）的电离源；其中，ESI电离源因具有和液相色谱良好的兼容性常作为液相色谱质谱联用中的离子化装置。

鉴于目前蛋白质的鉴定研究需要，本申请的发明人拟提供一种一维分离鉴定的蛋白质组学方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种新的蛋白质组的分离鉴定方法，具体涉及一种基于一维长柱液相色谱串联质谱的蛋白质组分离鉴定方法。该方法结合长柱的一维反相色谱分离优势和串联质谱对肽段的鉴定，能对蛋白质组样品进行快速高效的分离鉴定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）选择合适的蛋白质样品预处理方法；

（2）选择合适的色谱柱长度；

（3）设计合适的色谱分离时间和梯度。

具体的，本发明的基于一维长柱液相色谱串联质谱的蛋白质组分离鉴定方法，利用长色谱柱在合适梯度在7小时内鉴定到4000个以上蛋白质，其包括：

(1)裂解液从细胞或组织中提取全部蛋白质混合物；

(2)蛋白质经沉淀，重悬，进行还原烷基化；

(3)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶解成肽段混合物；

(4)将酶解获得的肽段混合物进行一维液相色谱串联质谱鉴定。

本发明的鉴定方法中，所述的色谱柱长度为色谱分离柱长度大于40cm，典型的长度为50cm；所述的色谱梯度为三步长梯度洗脱；

本发明的鉴定方法中，所述步骤（1）中裂解液包含100mM TrisHCl pH 7.6 ，2%以上SDS和DTT以及蛋白酶抑制剂，溶解产物在80摄氏度以上高温孵育5分钟；本发明的一个实施例中，优选所述裂解液包含100mM TrisHCl pH 7.6 包含4%SDS和100mM DTT以及蛋白酶抑制剂；

本发明的鉴定方法中，步骤（2）中采用甲醇-氯仿进行沉淀；

本发明的鉴定方法中，步骤（3）中不局限于一种酶的酶解，使用胰蛋白酶、GluC或Lys-c等特异性酶中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶解；本发明的一个实施例中，优选的，采用Lys-C和Trypsin组合酶解；

本发明的鉴定方法中，步骤（4）中采用50cm反相色谱柱进行鉴定；其中，

反相色谱分离柱填料粒径为1.8-5 μm，填料孔隙率为10nm-50 nm，反相色谱分离柱长度大于40cm,典型的长度为50cm，流速为100-500 nL/min；

本发明的鉴定方法中，所述三步长梯度洗脱，最优化条件为流动相A为pH 2-5的2%乙腈0.1%FA水溶液，流动相B为pH 2-5的98%乙腈0.1%FA水溶液，在0-30分钟分别采用0－10％B；在30-240分钟分别采用10－20％B的梯度；在240-340分钟分别采用20－35％B的梯度；之后340-345分钟均采用35－80％B剃度、345-355分钟均采用80％B的等度洗脱、355-360分钟均采用80-0％B的梯度；360-400分钟采用0%B对色谱柱进行平衡。

更具体的，本发明的基于一维长柱液相色谱串联质谱的快速高效蛋白质组分离鉴定方法，其特征在于，包括步骤： 

（1）细胞用PBS冲洗，洗净培养基后用胰酶消化细胞；