[发明专利]一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

权利要求书

1.一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列；

（2）然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转；

然后将检测不同C位点的开环探针I和开环探针II放置于同一反应管中，并进行杂交连接，若特定C位点发生羟甲基化，则开环探针I能连接成环；若未发生羟甲基化，则开环探针II能连接成环；

（3）再将步骤（2）连接成环后产物同步骤（1）芯片杂交，固定芯片的滚环扩增引物以连接成环后产物为模板进行滚环扩增；然后采用不同荧光检测探针同芯片杂交，根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小，从而实现快速检测待测基因组DNA中5-羟甲基化胞嘧啶。

2.根据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（1）所述的滚环扩增引物长23bp，其包括5’端8个T和3’端15bp，近3’端15bp与开环探针I或开环探针II的5’端的15bp序列互补。

3.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，所述芯片是普通玻璃片或是微球，其表面是聚丙烯酰胺修饰；被固定的扩增引物5’端为丙烯酰胺基团修饰。

4.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（2）所述的开环探针I和开环探针II均为合成的寡核苷酸，开环探针I和开环探针II均由4部分组成，分别包括30bp 的C位点检测部分、17bp的通用荧光检测探针杂交部分、15bp的通用扩增引物杂交部分以及5bp的连接序列部分；其中开环探针I和开环探针II的C位点检测部分和通用荧光检测探针杂交部分不同，而通用扩增引物杂交部分和连接序列部分的序列长度和组成均相同。

5.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（2）所述的连接成环是指开环探针I或与开环探针II分别与对应的C位点所在序列互补配对后，开环探针I或与开环探针II的5’和3’端在连接酶作用下被连接起来。

6.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（3）所述的滚换扩增，是指连接成环的探针与芯片固定的滚环扩增引物杂交后，扩增引物以连接成环的探针为模板进行引物延伸反应。

7.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（3）所述的不同荧光检测探针是指若C位点碱基为C或mC则荧光探针为Cy3标记，若C位点碱基为hmC则荧光探针为Cy5标记。