[发明专利]朗德鹅肥肝生产性能检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种朗德鹅肥肝生产性能的快速检测试剂及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肝脏在家禽脂类代谢中起着至关重要的作用，是脂肪酸合成的主要部位，约占脂肪酸合成的90%以上，肝脏脂肪的大量沉积是肥肝形成的主要原因。鹅肥肝是在鹅的生长发育后期，采用人工强制填饲超额能量饲料，使短期内脂肪大量在肝脏沉积而成，其营养丰富含有大量的不饱和脂肪酸、卵磷脂，还含有大量的必需脂肪酸，与正常肝相比，鹅肥肝中卵磷脂含量增加4倍，脱氧核糖核酸与核糖核酸增加1倍，酶的活性提高3倍，并含有多种维生素，其对降低人体血液中胆固醇含量、软化血管、延缓衰老以及预防心脑血管疾病发生有一定的功效，而朗德鹅则以优良的肥肝性能著称于世。

随着分子生物学技术的发展，人们对脂肪肝形成机理的研究也不断深入，而寻找与肝脏脂肪代谢密切相关的基因的研究已成为主要方法。硬脂酰辅酶A去饱和酶（Stearoyl-CoA desaturase,SCD）基因在朗德鹅肝脏中表达水平较高，且在填肥肝脏中的表达水平显著高于正常肝脏，并随着鹅肥肝的形成而显著升高，是影响肝脏脂肪沉积的关键基因。SCD是一种内质网酶，是合成单不饱和脂肪酸的限速酶，它主要催化饱和脂肪酸——硬脂酰辅酶A（C16：0）和棕榈酰辅酶A（C18：0）在第9和10碳原子间导入氢键，分别形成单不饱和脂肪酸——油酸（16：1）和棕榈酸（C18：1），是合成膜磷脂、胆固醇酯（CE）、蜡酯和甘油三酯（TG）的底物，甘油三酯和胆固醇酯是肝内装配和分泌VLDL的重要成分，缺乏时会引起脂质酯化障碍，改变细胞膜的脂质构成，影响细胞功能。SCD基因是调控脂肪代谢的一种关键酶，该基因的表达及其产物的活性，决定脂肪细胞单不饱和脂肪酸的合成及细胞膜磷脂和甘油三酯的组成，不仅与人类相关疾病如肥胖症、糖尿病及高血压等密切相关，也是改善动物产品脂肪酸组成的候选基因。通过对SCD1基因多态性的研究，找到与产肝性能紧密相关的分子标记，从而可以在早期对朗德鹅进行选择，筛选出高产肝性能的优质肥肝鹅。由于在SCD1基因的编码区上未找到与产肝性能显著相关的SNP，而基因的3’UTR可能存在着一些序列元件，在转录断裂、聚腺苷酸化、核转运以及调节转录表达和稳定性方面起着重要的作用，它们也可能对一些重要性状产生影响，因此检测SCD1基因3’TUR上的SNP，并研究其与朗德产肝性能之间的关系，有可能找到与产肝性能密切相关的分子标记，从而有助于高产肝系能朗德鹅的筛选和培育。

发明内容

本发明涉及一种朗德鹅肥肝生产性能的快速检测试剂盒及检测方法。

本发明所述用于检测朗德鹅肥肝生产性能的试剂盒包括：①特异性PCR引物3对，序列如SEQ ID NO.1-6所示、②10×Buffer、③MgCl₂、④dNTP混合物、⑤Taq酶(5U/μL)、⑥ddH₂O。

通过检测硬脂酰辅酶A脱饱和酶1（SCD1）基因3’UTR的多态性区分个体产肝性能的差异，使用本发明的产品和方法可以达到快速鉴定朗德鹅产肝性能的目的，操作简便，准确性高，对于朗德鹅高产肝性能的选育具有重要作用。

本发明试剂盒的使用方法：预先采用常规酚/氯仿抽提法获得朗德鹅基因组DNA后，利用本试剂盒①-⑥进行硬脂酰辅酶A脱饱和酶1（SCD1）具有的PCR扩增，将扩增产物送生物公司测序，进行突变位点的分析。其中，在SCD1基因3’UTR上的610、759、835、860和1025bp处分别为G、C、G、A和C的纯合型，即单倍型组合（GCGAC/GCGAC）时，产肝性能较好，且体重较小。

本发明的优点：本发明基于分子生物学原理和研究结果设计，试剂盒中所有试剂均为可以直接使用的工作液，使用本发明只需要采取少量鹅血和基本的分子生物学实验条件，按照本发明提供的检测方法可以简单快速的检测朗德鹅的产肝性能，而且可以实现对样本的大规模检测。

具体实施方式

6种工作液的来源或制备：

①特异性PCR引物（表1）

引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物为干粉状，加入ddH₂O溶解，4℃保存备用。

②10×Buffer

上海生工生物技术有限公司购买Taq酶时配套赠送

③MgCl₂

上海生工生物技术有限公司购买Taq酶时配套赠送

④dNTP混合物