[发明专利]一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法，特别涉及一种鱼用细菌疫苗海洋交替假单胞菌优化发酵条件后的发酵培养方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

早在1942年，Duff首次应用灭活的杀鲑产气单胞菌口服免疫硬头鳟获得成功。虽然该实验未能被后人重复证实，但毕竟开创了疫苗在鱼类应用上的新纪元。此后许多人探索性的研究、制备疫苗，对那些爆发性和难以用药物防治的鱼病进行免疫预防。其中弧菌病菌苗、肠道性红嘴病（ERM）菌苗等获得了成功。1975年，美国疫苗有限公司（AVL）开始生产商品型鱼用疫苗。1984年2月，首次鱼用疫苗接种研讨会在法国巴黎举行。这次会议是鱼用疫苗发展史上的一个重要里程碑。从此，新技术、新方法逐渐被用于病毒病疫苗、高效价菌苗的研制。

我国对鱼类疫苗研究起步较晚，始于1955年，进展较慢。其中，草鱼出血症疫苗的研制代表了我国水产疫苗从低级向高级发展的历史历程。经过30余年的发展，针对草鱼出血症先后研制出4种开创性疫苗。经过实验探索、生产应用，鱼类疫苗的研究已进入用新技术和新方法研制高效疫苗的时期。到目前为止，我国获得国家新兽医证书的水产疫苗产品仅有三种，分别是草鱼出血病细胞灭活疫苗、鱼嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗和牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗，同发达国家相比有较大差距。此外，迄今为止尚有许多鱼类疾病的病原菌还不能分离培养并鉴定；有些鱼类的病原菌还不能被直接灭活制成疫苗；这些导致我国水产疫苗的研制发展缓慢，每年的鱼类病害造成的损失巨大。

鱼用疫苗在防病效果上具有不可替代性的优点。首先，鱼用疫苗能有效地保护环境和食用鱼的品质，安全的鱼用疫苗使用后没有污染，在鱼体内没有残留，不会对鱼体产生耐药性；其次，对有些难以用药物防治的鱼病，使用鱼用疫苗是有效的方法之一；再次，随着养殖的强化，大水面鱼病的暴发呈上升趋势，从经济的角度考虑，应用鱼用疫苗免疫预防是一个有效的措施；最后随着研究的深入，联苗、多价疫苗以及基因工程疫苗的应用，它们的防病效果将会大大超过化学药品等其它防治措施，提高经济效益。

海洋细菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)分离自海洋，由于其具有杀灭鳗弧菌等引起水产养殖动物疾病的病原菌，因此被广泛的研究利用于鱼用疫苗的研制工作中。

中国专利文献CN102266356A（申请号201110215570.9）公开了一种微生物杀菌剂的制备方法，属微生物发酵工业领域。本发明公开了一种利用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)制备鳗弧菌杀菌剂的方法，由(1)菌种的斜面活化培养，(2)液体发酵培养，(3)发酵液粗提，(4)抑菌剂的制备等步骤组成。

目前,假交替单胞菌的培养发酵主要为2216E培养基、Zobel2216E培养基或EM培养基等海水培养基。如中国专利文献CN102942516A（申请号201210437136.X）公开了将假交替单胞菌保藏号为CGMCC No.6555划线接种到固体斜面培养基上，于30℃，培养1天后，接种1个菌落到EM培养基中，于30℃，150rpm下摇床培养7天，获得发酵产物的步骤。

上述海水培养基是为了模拟假交替单胞菌的生存环境，从而有利于其生长。但上述培养条件由于培养速度慢，已无法适应大规模工业化生产的需要。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，本发明提供一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法。

术语说明

海洋交替假单胞菌：生长于海洋中的交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）。

本发明的技术方案如下：

一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：

取活化后的海洋交替假单胞菌，按重量百分比1.0%～5.0%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度20℃～40℃、转速120～260r/min，装液体积百分比10%～30%，发酵培养15～28h，即可；

上述低盐发酵培养基每升组分如下：

蛋白胨5～50g、酵母浸粉0.1～15g、NaCl浓度为5～30g、蔗糖5～50g、FeCl₃0.01～1g，水定容至1L，pH7～8。

根据本发明优选的，低盐发酵培养基每升组分如下：

蛋白胨5～30g、酵母浸粉0.1～10g、NaCl浓度为10～20g、蔗糖5～30g、FeCl₃0.01～0.5g，水定容至1L，pH7.5。

根据本发明优选的，所述的水为自来水、去离子水或蒸馏水。