[发明专利]一种利用磷霉素选育达托霉素高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌种筛选的技术领域，特别涉及利用磷霉素筛选达托霉素高产菌株的技术。 

背景技术

随着抗生素药物在临床上的广泛应用，细菌的耐药性问题越来越严重，引起人们的广泛关注。万古霉素长期以来一直作为防御许多严重革兰氏阳性菌感染的最后防线，但随着频繁的临床应用，其耐药菌株也越来越多，万古霉素目前临床应用已非十分理想。因此研发新型的抗耐药菌抗生素就具有非常重要的意义。 

达托霉素(daptomycin/Cubicin)是由礼来(Lily)公司最初研究，Cubist制药公司开发的一种环脂肽类抗生素。2003年9月，作为一种全新结构类别的抗生素在美国首次上市。这种抗生素是从玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵液中提取得到的一个环脂肽类物质，它不仅具有新颖的化学结构，而且其作用模式也与任何一个已获批准的抗生素都不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的。 

由于其独特的抗菌特性及良好的市场前景，近几年来，国内不少单位陆续开始研究。2006年，天津大学公开了一种激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法：2007年由中国科学院上海有机化学研究所公开了一种达托霉素的合成方法。国内也有人在做菌种的筛选和遗传育种工作，但是都是刚刚开始，还没能够达到工业化生产的要求，所以，如何提高roseosporus链霉菌中的达托霉素的产量将对其产业化生产，以及产品的销售和市场占有份额都具有重要的意义。 

磷霉素是通过阻碍细胞壁合成中UDP-GlcNAc-丙酮酸转移酶的反应，从而抑制细胞壁的合成。可以设想，如果以磷霉素(FOM)为“筛子”，凡是对FOM敏感度高的菌株，则其细胞壁合成中的这一点就可能有缺陷，使之不能很好地合成细胞壁，而转向合成抗生素，达到选育高产菌株的目的。范铭琦等利用磷霉素筛选氨基糖苷类抗生素GMC1a高产菌株中获得了成功，与亲株相比效价提高了75～101％。而把磷霉素应用与达托霉素产生菌的选育方面，则未见相关的专利和文献的报道。 

发明内容

本发明的目的是提出一种利用筛选对磷霉素敏感的玫瑰孢链霉菌从而获得达托霉素高产菌株的方法，依此方法可有效的提高达托霉素的产量。 

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：一种利用磷霉素选育达托霉素高产菌株的方法， 其特征在于包括以下过程：玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)亲株的斜面孢子用无菌水制成10⁵-10⁷个孢子/ml的单孢子悬液，将1-3ml的孢子悬液分装于玻璃皿中，于15瓦紫外灯下处理0.5-1.5分钟，然后将辐射处理的孢子悬液用无菌水稀释到10^-3-10^-5后，涂布于培养平板中26-28℃培养7-8天，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有200-1000μg/ml的磷霉素的筛选平板上，挑取对相应浓度磷霉素敏感的菌落，于斜面培养基培养6-7天后，接种于装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶，于28-30℃，转速为200-220rpm的摇床中培养120-160h，通过HPLC，检测达托霉素产量，从而获得高产的达托霉素产生菌。 

上述的筛选平板中磷霉素的含量为：200μg/ml或400μg/ml或600μg/ml或800μg/ml或1000μg/ml。 

上述的液体发酵培养基组成及质量含量为：可溶性淀粉6-10g，酵母粉4-6g，糊精10-20g，干酪素3-5g，胰蛋白胨4-10g，K₂SO₄3-5g，L-天冬酰胺1-3g，溶于1L自来水中，PH7.5。 

本发明采用的通过筛选磷霉素敏感菌株来获得达托霉素高产菌株，设备简单、方法宜行、效果良好，选育出的菌株正突变率为1-25％，发酵单位比出发菌株提高0.3-2.9倍。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。