[发明专利]肝祖细胞

权利要求书

1.一种非卵圆人肝多能祖细胞系，其表达肝细胞标记。

2.权利要求1的细胞系，所述细胞系表达肝细胞标记白蛋白和α-甲胎蛋白。

3.权利要求1或2的细胞系，所述细胞系表达肝细胞标记CK18。

4.权利要求1-3中任一项的细胞系，所述细胞系表达干细胞标记CD44、CD29、CD73、CD146、CD105和CD90。

5.权利要求1-4中任一项的细胞系，所述细胞系不表达造血细胞标记。

6.权利要求1-5中任一项的细胞系，所述细胞系不表达造血干细胞标记CD133。

7.权利要求1-6中任一项的细胞系，所述细胞系不表达卵圆细胞标记CD117（C-kit）、CK19和CD34。

8.权利要求1-7中任一项的细胞系，所述细胞系不表达成熟肝细胞标记细胞色素P450，不合成尿素。

9.权利要求1-8中任一项的细胞系，所述细胞系能够分化为成熟肝细胞和产胰岛素细胞。

10.权利要求1-9中任一项的细胞系，所述细胞系是永生化的。

11.一种分离权利要求1-9中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系的方法，所述方法包括以下步骤：

（i）在细胞培养基中培养成体肝脏来源的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择具有上皮样形态的存活细胞群；

（ii）通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF（人上皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素的培养基中培养，扩增具有上皮样形态的存活细胞群。

12.权利要求11的方法，其中所述成熟肝细胞在防冻剂存在下冷冻在含血清培养基中，然后在按照步骤（i）培养前融化。

13.权利要求12的方法，其中所述防冻剂是二甲亚砜。

14.权利要求11-13中任一项的方法，其中步骤（i）的细胞培养基是肝细胞培养基。

15.权利要求11-14中任一项的方法，其中步骤（ii）的含血清培养基是补加胎牛血清（FCS）或人血清（HS）、抗生素和谷氨酰胺的αMEM-EBM（3:1体积/体积)的混合物。

16.权利要求11-15中任一项的方法，其中所述成熟肝细胞按照步骤（i）培养至少2周。

17.权利要求11-16中任一项的方法，其中所述分离的非卵圆人肝多能祖细胞系还进行条件永生化。

18.权利要求11-17中任一项的方法，其中还通过在培养基中用半乳糖代替葡萄糖，使所述分离的非卵圆人肝多能祖细胞系进行代谢选择。

19.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为成熟肝细胞的方法，所述成熟肝细胞能够表达成熟肝细胞标记细胞色素P450并能够合成尿素，所述方法包括在补加肝细胞生长因子即HGF和成纤维细胞生长因子4（FGF-4）的含血清培养基中培养所述细胞系。

20.权利要求19的方法，其中所述含血清培养基是补加10%FCS或HS、HGF和FGF-4的MEM-EBM。

21.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为产胰岛素细胞的方法，所述方法包括在至少2g/l葡萄糖存在下在含血清培养基中培养所述细胞系。

22.权利要求21的方法，其中所述含血清培养基还包含烟酰胺。

23.权利要求21或22的方法，其中所述含血清培养基是补加2%FCS或Hs、4.5g/l葡萄糖和10mM烟酰胺的DMEM。

24.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为成骨细胞的方法，所述方法包括在补加抗坏血酸-2-磷酸酯和地塞米松以及无机磷酸盐的含血清培养基中培养所述细胞系。

25.权利要求24的方法，其中所述含血清培养基是补加10%FCS、10%HS、1nM地塞米松和0.5μM抗坏血酸-2-磷酸酯的αMEM。