[发明专利]一种选育维生素C二步发酵小菌的增殖方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物与医药技术领域，特别是涉及一种维生素C二步发酵小菌的选育过程中的增殖方法及应用。 

背景技术

维生素C（VitanunC，Vc）是人体营养必需的维生素，其不仅作为重要的医药产品用于治疗多种疾病，也广泛用于食品、饲料及化妆品中。随着维生素C应用范围的增加，市场需求量日益增大，使人们对VC生产技术不断地进行研究、改进。 

目前，维生素C的发酵生产采用二步法实现，即采用芽孢杆菌（俗称大菌，主要有巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌）和氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌）混菌发酵，其中小菌为产酸菌，可以产生2-酮基-L-古龙酸，但单独存在产酸能力较小；而大菌本身不产酸，但其与小菌共同发酵有明显促进小菌产酸的作用，大菌为小菌的伴生菌，在整个发酵中小菌起到关键的作用。研究证实，大菌营养体在变成芽孢过程中，释放细胞内含物，使蛋白质含量增加，可以促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期。 

现有技术中，VC二步发酵法中小菌的选育是通过将混菌种子液分离至平板培养，大小菌分离后收集一定数量的小菌混合体，进行群体处理。经处理后的小菌涂布至平板并搭大菌培养后，收集足够数量的小菌混合液接斜面，搭接大菌培养，最后进行筛选。 

由于小菌个体微小，菌量较少，一个小菌的菌量不够接一支斜面。如单菌落不进一步进行增殖培养，仅仅采用现有技术，将收集的处理后小菌混合体整体接斜面，然后搭大菌培养后筛选，实质上并未实现对小菌进行单独的筛选。因为不是被处理小菌单菌落的逐一筛选，致使未变异菌落与变异菌落、正突变与负突变的菌落无法单独体现，所以目的菌株优良特性很难得到充分表达，给筛选工作增加难度。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效表达菌种诱变的效果，使具有各类特性的菌株性能得到单独体现，从而很容易获得目的菌株，降低维生素C二步发酵法中小菌的选育难度，获得的目的菌株的糖酸转化率明显的提高。 

为实现上述发明目的所采取的技术方案为： 

一种维生素C二步发酵小菌的增殖方法，其特征是：将经过物理或者化学方法处理的小菌稀释后涂布至平板（所用培养基为分离培养基（g/100ml）：L-山梨糖1.5，玉米浆0.3，蛋白胨0.5，尿素0.4，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄ 7H₂O  0.02，琼脂2.0，pH值为7.0，121℃灭菌30min），28-30℃培养2-3天。用接种环逐一挑取小菌单菌落，采用划线法分别涂至分离平板（所用培养基同分离培养基），接种环挑取大菌均匀接至已涂布小菌的平板中增殖培养。28-30℃增殖培养2-3天。

一种选育维生素Ｃ二步发酵小菌的增殖方法的应用，其特征是：将增殖后的小菌逐一接斜面（所用培养基为（g/100ml）：L-山梨糖1.5，玉米浆0.3，蛋白胨0.5，尿素0.4，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄ 7H₂O  0.02，琼脂2.0，pH值为7.0，121℃灭菌30min），用接种针挑取大菌接至已涂布小菌的斜面中，28-30℃培养2-3天。 

    生长好的斜面菌苔取2环接种至种子培养基（所用培养基为（g/100ml）：L-山梨糖1.5，玉米浆0.3，尿素0.5，蛋白胨0.4，碳酸钙0.3， pH值为7.0，121℃灭菌30min），28-30℃下200r/min振荡培养16h。按10%接种量移入发酵培养基（所用培养基为（g/100ml）：L-山梨糖8.0，玉米浆1.5，尿素1.2，碳酸钙0.3， pH值为7.0，121℃灭菌30min），28-30℃下200r/min振荡培养3-4天。检测发酵液古龙酸含量及残余L-山梨糖浓度。根据实验数据统计分析，选出目的菌株。 

本发明将小菌单菌落，采用增殖培养的方法进行维生素C二步发酵法中小菌的选育筛选，使具有各类特性的菌株性能一一得到体现。成功地淘汰了非目的菌株而得到目的菌株，使获得优良性能目的菌株的几率得到提高，降低维生素C二步发酵法中小菌的选育难度，有效的提高二步发酵产古龙酸的含量及糖酸转化率。 

  

具体实施方式

下面所例举的具体实施例仅仅是对本发明的解释说明，不构成对本发明的任何限制。 

实施例1