[发明专利]一种用于染色体数目异常快速检测的半特异性扩增引物组、方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及生物技术和医学，具体涉及一组针对基因组长散在元件（Long Interspersed Elements，LINE）进行半特异性扩增的引物，及以该引物组为核心的快速构建DNA测序文库的方法,同时涉及一种染色体数目异常检测的试剂盒与方法。

背景技术

上世纪70年代中期Frederick Sanger发明了Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）^[1]，使得直接检测DNA序列成为了可能。其通过一个聚合酶连锁反应（PCR）来完成测序过程。通过随机加入ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP四种双脱氧核糖核苷酸使得PCR扩增出不同长度的片段，通过对片段末端双脱氧核糖核苷酸种类的检测从而检测出原DNA样品的序列。该方法经过不断的改进与完善，逐渐成为了当时主流的测序方法，即第一代测序技术。然而传统的第一代测序方法存在着通量小、周期长、成本高等诸多缺陷，已经不能满足研究以及应用的需要。随着科学水平的发展，DNA测序技术也有了质的变革。以Roche/454FLX、Illumina/HisSeq以及Applied BiosystemSOLID system三大平台为代表的第二代测序技术得到了充分的发展。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，并且通过不同的手段检测末端的标记来确定DNA序列。DNA测序的费用越来越低，测序通量越来越高，测序速度越来越快。以Illumina/HisSeq为例，Genome Analyzer的通量由最开始的50 M序列到后期改进后提高到300M序列，而目前最为成熟的HisSeq 2000 每次运行的通量可达300G，而人的基因组的碱基含量约为3G。换句话说，即便每个人测100G的数据，HisSeq 2000运行一次也可以检测3个人的全基因组序列。

随着成本的降低，通量的提高以及测序技术指标的提升，测序技术已从单纯应用于研究开始越来越多地应用于实际，尤其是应用于临床医学领域。单基因病的检测，染色体数目异常检测等，个体化用药指导等等均是在高通量测序的基础上加以实现的。如对于慢性骨髓白血病非常有疗效的甲磺酸（Gleevec）就是通过检测测序并根据其所含信息被人们所发现的^[2]。这些大多是针对出生后个体而言，对于胎儿相关疾病的筛查也有了长足进步。这一方面取决于孕妇外周血中胎儿游离DNA的存在^[3]，另一方面取决于高通量测序技术的发展。以检测孕妇外周血中游离DNA序列为核心，开发出了多种无创筛查胎儿疾病的方法，如鉴定RH血型、染色体拷贝数异常、大片段的染色体结构异常等^[4-5]。

目前临床上应用测序技术检测疾病的过程主要分为三部分：样品获得及文库制备、测序、数据分析三个部分。具体而言，样品主要为病人外周血或其他组织材料；文库制备则主要包含DNA提取，修补平末端，3’端加A，与3’端带有T的接头连接，以及PCR扩增形成文库；测序则是指将建好的测序文库在第二代测序仪上进行测序的过程；最后得到的测序序列通过比对以及其他各种生物学模型分析，得出结论。

长散在元件（Long Interspersed Elements，LINE）是在真核细胞基因组中大量存在的一组元件。人类基因组中约有17%为LINEs。该元件的核苷酸序列具有非常高的相似性，并且在基因组各个染色体上均有大量的拷贝存在。因此一对特定的引物可以将大部分LINE扩增出来^[6-7]。为了进一步降低成本，提高通量以及检测精确度，我们根据LINE元件多拷贝性以及广泛分布在各个染色体上的特点发明了一种利用测序技术检测大范围的染色体数目异常的方法。该方法不仅适用于出生后个体的大范围染色体结构变异以及染色体数目异常检测，同时也可以实现胎儿无创的染色体数目异常检测。具体而言，我们通过遍历整个人类基因组的参考序列，寻找到LINEs序列，针对LINEs区域设计探针，通过两步PCR完成DNA富集以及文库构建的过程，并且通过后续的生物信息学分析，检测整个染色体水平的数目异常。由于是检测部分基因组信息，因此在相同通量下，对目的区域可以有更深的测序深度，无论是对个体DNA而言还是对孕妇外周血中游离的胎儿DNA而言都可以更精确、简便地检测染色体异常。

参考文献