[发明专利]一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法，属于分子生物学PCR遗传鉴定领域。

背景技术

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦称沟鲶（Channel Catfish），属鲶形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae）、叉尾鮰属（Ictalurus）。它原产于北美，其自然分布区在美国中部、加拿大南部和墨西哥北部。斑点叉尾鮰属名贵淡水经济鱼类，深受美国、加拿大及其它许多国家消费者的喜爱。加工好的成品或半成品在美国、日本、欧洲和加拿大等地市场均很畅销，市场需求量极大。自1984年，我国湖北省水产研究所首次引进斑点叉尾鮰，随着繁育、养殖以及加工技术的日趋成熟，再加上高额的投资回报效益，使得斑点叉尾鮰的养殖业和加工业在我国迅速蓬勃发展，出口创汇效益也逐年攀升。

近年来，曾被美国政府视为“反倾销”而遭封杀的越南巴沙鱼贴着“中国斑点叉尾鮰”的标签进入美国市场，这不但严重损害我国斑点叉尾鮰的品牌，影响了我国斑点叉尾鮰产品的正常出口，而且扰乱了国际斑点叉尾鮰市场，我国出口企业因被美国以物种不符为由多次退货遭受巨大经济损失。作为主要依托科技手段保障经贸发展的出入境检验检疫部门也已经面临一项全新的任务和挑战。

对于已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，由于形态已发生完全改变，主要依据骨骼结构和外部形态特征的传统物种鉴定方法在斑点叉尾鮰的物种鉴定上已完全不适用。此外，在成品和半成品中，由于细胞结构的破坏和蛋白质的严重变性，依据染色体特征的细胞分类学方法以及依据同功酶数据的酶学鉴定方法等也同样不适合斑点叉尾鮰的物种鉴定。

随着PCR技术和DNA测序技术的日趋成熟，通过DNA序列信息了解物种之间的遗传分化变得越来越普遍。线粒体DNA以其进化速率快，遵循母系遗传等特点，成为种群遗传学研究的有效标记之一。有关科技查新结果表明，国外已有线粒体DNA的PCR-RFLP的数据进行鳕鱼、比目鱼等制品中物种鉴定的报道，但均没有线粒体DNA的D-loop区的分子数据来进行斑点叉尾鮰物种鉴定方面的报道。而且PCR-RFLP方法操作过程繁琐，多用于对同一物种的不同群体进行遗传多态性分析，不适于快速、经济的鉴定斑点叉尾鮰物种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法，解决现有技术的不足，利用已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，快捷方便的鉴别出斑点叉尾鮰物种。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，包括以下分离包装的试剂：裂解液、抽取液Ⅰ、抽取液Ⅱ、PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照；

所述裂解液PH值为8，包括以下组分：200mmol/L NaCl、20mmol/LTris-HCl、50mmol/L EDTA、1%SDS，其余为水；

所述抽取液Ⅰ包括苯酚、氯仿和异戊醇，其中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1；

所述抽取液Ⅱ包括氯仿和异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1；

所述PCR反应液包括以下组分：10×PCR Buffer、MgCl₂、dNTPs、上游引物、下游引物、Taq DNA聚合酶，其余为超纯水；具体引物序列为：

上游引物：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，

下游引物：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；

所述酶切反应液包括10×Buffer和EcoR Ⅰ；

所述阳性对照为PCR扩增后已酶切鉴定过的斑点叉尾鮰D-loop标准样品（即已知的斑点叉尾鮰物种D-loop进行PCR扩增和酶切之后得到的产物结果）；

所述阴性对照为PCR扩增后未酶切的斑点叉尾鮰D-loop标准样品（即已知的斑点叉尾鮰物种D-loop进行PCR扩增不进行酶切得到的产物结果）。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述PCR反应液中，含有10×PCR Buffer2.5μl、MgCl₂2.0μl、dNTPs2.0μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.5μl，以及超纯水16μl。

进一步，所述酶切反应液中，含有10×Buffer2.0μl和EcoRⅠ1.0μl。