[发明专利]一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法

权利要求书

1.一种利用SKPs制备组织工程脊髓的方法，包括以下步骤：

1)、分离SKPs

将皮肤样品酒精消毒后，胰酶消化，然后将真皮组织剪成细胞片并碎吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中，2h后，将悬浮的细胞离心后转移到SKPs生长培养基中，培养约7天后，可见悬浮克隆样生长的细胞SKPs；

2)、SKPs快速扩增

将分离得到的SKPs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增，所述扩增培养基中含有FGF2 40-60ng/ml和PDGF 40-70ng/ml。

3)、制备组织工程脊髓

将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含NT3、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，然后吸走培养皿中的液体，将组织工程脊髓材料经过梯度酒精脱水后，真空干燥；将扩增后的SKPs，以脑源性神经营养素(brain derived neurotrophic factor，BDNF)腺病毒表达载体感染，12h后收集细胞接种到上述的工程脊髓材料材料上，加入培养基培养。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中，所述皮肤样品为，0.5×4cm²的全层皮肤。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中，所述胰酶质量体积浓度为0.25％，所述SKPs生长培养基为：含40ng/ml FGF2和20ng/ml EGF的DMEM-F12培养基；培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)中，所述扩增培养基为含有50-100ng/ml FGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子的DMEM-F12培养基。培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤3)中，所述组织工程脊髓材料饱和水溶液和所述生理盐水的体积比为1∶1，所述生理盐水中NT3、维甲酸和Neuregulin的浓度分别为10ng/ml、6ng/ml和10ng/ml，所述静置时间为30-40min。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤3)中，细胞接种密度为5×10⁵/ml，培养基组分为含40ng/ml FGF2和20ng/ml EGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。