[发明专利]一种前导肽C端α-螺旋37-42缺失的谷氨酰胺转胺酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酰胺转胺酶突变体，特别是一种前导肽C端α-螺旋^37-42缺失突变的谷氨酰胺转胺酶突变体，属于酶工程领域。 

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。 

链霉菌TGase是以无活性的酶原(pro-TGase)进行合成和分泌，其N端前导肽(pro-peptide)被胞外活化蛋白酶切割后，才会使TGase表现出催化活性。前导肽位于TGase活性裂缝上方，形成一个L状结构，由N端α-螺旋、中间松散的loop和C端小α-螺旋组成。其N端25个氨基酸(9-33)位于成熟酶活性裂缝内，其中Y12和Y16位于催化位点Cys64-Asp255-His274的上方，阻止了底物酰基受体和供体的进入，从而使pro-TGase无催化活性。链霉菌来源TGase前导肽对pro-TGase折叠和分泌具有重要影响。 

为提高谷氨酰胺转胺酶表达量低的现状，本研究通过氨基酸缺失对谷氨酰胺转胺酶前导肽进行缺失，提高谷氨酰胺转胺酶的分泌量与催化活性。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种谷氨酰胺转胺酶突变体，编码所述谷氨酰胺转胺酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述突变是对吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶前导肽C端α-螺旋^37-42进行缺失突变，从而提高了谷氨酰胺转胺酶的催化活性。 

本发明解决的另一个技术问题是提供构建所述突变体的方法，是通过定点突变技术将吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶前导肽C端α-螺旋^37-42进行缺失突变。包括以下步骤：以含有编码吸水链霉菌pro-TGase的基因的质粒为模板，利用定点突变技术，对pro-TGase前导肽C端α-螺旋^37-42进行缺失突变，将含有突变体基因的表达载体测序验证后，转化表达宿主E.coli BL21。 

对pro-TGase前导肽C端α-螺旋^37-42进行缺失突变所用引物为Pro-37-42-F： 

5’-GCGGAATTGCCGCCGAGCGTC-3’；Pro-37-42-R： 

5’-ACCCGCAGTCAGGGCCCTTTTGTTC-3’。 

本发明通过对pro-TGase前导肽C端α-螺旋^37-42进行缺失突变，纯化并检测酶学性质，与野生酶相比，突变酶比酶活提高13.7%，TGase催化活性得到显著提高。 

附图说明

图1为SDS-PAGE分析前导肽C端区域缺失对pro-TGase分泌的影响；a:发酵液上清；b：全细胞；1：野生酶；2：pro-37-42；3：pro-43-52；4：pro-37-52；M：蛋白质标准分子量。 

图2为SDS-PAGE分析前导肽突变酶pro-TGase分泌过程；发酵上清部分，a：野生酶，c：pro-37-42，e：pro-43-52，g：pro-37-52；全细胞部分，b：野生酶，d：pro-37-42，f：pro-43-52，h：pro-37-52。 

图3前导肽突变pro-TGase发酵过程曲线；a：菌体生长曲线；b：胞外总蛋白含量；c：发酵上清酶活；d：发酵上清比酶活●：野生酶；○：pro-37-42；▼：pro-43-52；△：pro-37-52。 

图4SDS-PAGE分析纯化后的TGase；M：蛋白质标准分子量；1：WT；2：pro-37-42；3：pro-43-52；4：pro-37-52。 

具体实施方式

培养基：LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/L KH₂PO₄，72mmol/L K₂HPO₄。