[发明专利]一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法有效
| 申请号： | 201310315546.1 | 申请日： | 2013-07-24 |
| 公开（公告）号： | CN103355285A | 公开（公告）日： | 2013-10-23 |
| 发明（设计）人： | 余光辉;向文豪;覃永华 | 申请（专利权）人： | 中南民族大学 |
| 主分类号： | A01N3/00 | 分类号： | A01N3/00;C12N5/04 |
| 代理公司： | 武汉华旭知识产权事务所 42214 | 代理人： | 周宗贵;刘荣 |
| 地址： | 430074 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 烟草 叶片 组织细胞 冷冻 保存 方法 | ||
1.一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、将烟草叶片愈伤组织细胞在培养基中培养，制得细胞悬浮液；
（2）、将细胞悬浮液离心并去上清液后，制得细胞液，将细胞液转移至冷冻保藏管中并在其中加入冷冻保护剂后密封；
（3）、将冷冻保藏管降温至4℃并在此条件下静置20-40分钟，然后继续降温至-20℃并在此温度下静置30-40分钟，继续降温至-40℃并在此温度下静置3-4小时，最后将冷冻保藏管在-80℃的温度下保存。
2.根据权利要求1所述的烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，其特征在于：步骤（1）中的培养基为浓度8%的蔗糖液体培养基，培养时间为5天。
3.根据权利要求1所述的烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，其特征在于：步骤（2）中将细胞悬浮液在4℃的条件下以800-1000 rpm的速度离心5-10分钟。
4.根据权利要求1所述的烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，其特征在于：所述的冷冻保护剂为灭菌后的山梨醇和二甲基亚砜，两者的体积比为2：0.9～1.1，细胞液中所加入的冷冻保护剂的量占细胞液的体积比为40%～50%。
5.根据权利要求1所述的烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，其特征在于：在步骤（3）冷冻保藏完成后，细胞复苏的培养步骤为：
a取出冷冻保藏管，检查冷冻保藏管是否密封；
b将冷冻保藏管立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在0.5-1.5分钟内全部融化，用酒精擦拭冷冻保藏管外部，然后将冷冻保藏管移入无菌操作台内；
c 将解冻的细胞液缓慢加入盛有培养基的培养容器内，稀释比例为1：10，混合均匀后将培养容器放入培养箱中培养；
d在培养后的隔日更换培养液即可完成细胞复苏。
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