[发明专利]蜡样芽孢杆菌B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治核桃枝枯病中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治核桃枝枯病中的应用。

背景技术

核桃枝枯病（Melanconium juglandinum Kunze.）主要为害枝干。多发生在1～2年生枝条上，有些地区普遍发生，病枝率可高达20%～30%。造成大量枝条枯死，对树体发育和核桃产量影响很大。受害枝条皮层变为暗灰褐色，后渐变成浅红褐色或灰色，大枝病部下陷。病死枝干的木栓层下散生分生孢子盘，成熟后大量孢子从盘中央顶破木栓层，病枝上散生小米粒大的黑点（分生孢子盘），直径0.2～0.3毫米，初期呈黑色短枝状物，湿度大时软化为黑色突起的孢子堆，直径约1～3毫米。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究尚未涉及。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。核桃枝枯病尚未涉及生物防治，该技术是生态学领域的一个应用学科分支，是基于生态平衡的原理，引进有益生物基因或基因产物，达到稳定、有效地防治靶标病（虫），生物农药(biopesticides)是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂，是生物防治的物质基础和重要手段。

发明内容

本发明人在杂交竹根际中发现蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）一新菌株B2，能有效防治核桃枝枯病。

该菌株于2010年6月14日分离自四川雅安市天全县杂交竹根际。经形态，生理，分子鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；该菌株已于2013年6月20日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：7767，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。

含有所述的B2菌株的液体制剂。

所述的液体制剂的制作方法，包括以下步骤：

①一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种蜡样芽孢杆菌B2菌株后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。

②二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成蜡样芽孢杆菌B2菌株液体种子。

③液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量体积比10%，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B2菌株液体制剂；所述的营养肉质培养液：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL。

B2菌株对病原菌的作用不仅局限在寄主枝干表皮部位抑制病原菌的定殖和生长，对病原菌在寄主表皮内的繁殖和扩散也起到较好的抑制作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

（一）蜡样芽孢杆菌B2菌株筛选

1.1供试病原菌

供试病原菌为核桃黑盘孢[Melanconium juglandinum Kunze]。

1.2芽孢的分离和纯化

取杂交竹根际土壤（表层10cm以下）装入无菌样品袋带回实验室，备用。每份样品称量10g转至装有90mL生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混匀后制成土壤悬浮液，放入100℃水浴中加热5min。冷却后，无菌条件下取1mL加入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀得到10^-2的样品稀释液，按照此法依次稀释，分别获得10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤稀释液，取10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤稀释液各0.1mL，分别采用稀释平板涂布法将其涂布在LB培养基上，倒置在30℃恒温培养箱中，48h后根据菌落形态特征，挑取单菌落进行平板划线，以保证菌落纯度，分别保存于斜面中，保存备用。

1.3生防芽孢杆菌的初筛