[发明专利]TREM-1胞外域的原核表达菌株以及在治疗猪链球菌感染引起的败血症中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种TREM-1胞外域的原核表达菌株以及在治疗猪链球菌感染引起的败血症中的应用。 

背景技术

髓系细胞触发受体1（triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1）是一种选择性表达于血液中性粒细胞和单核/巨噬细胞的细胞膜表面受体，属于髓系细胞触发受体家族的一员。TREM-1介导的信号转导通路可放大炎性应答反应，在感染性疾病、脓毒症、急性胰腺炎等免疫相关疾病的发病中也均发挥着重要作用，是近年来炎症反应发生机制研究中最重要的进展之一，被认为是致脓毒症等疾病的关键分子。 

目前，商品化的TREM-1胞外结构域的重组蛋白，为通过将小鼠TREM-1胞外段基因通过连接序列与人IgG1 pro100-lys330段编码基因融合，通过构建入真核表达质粒，转染小鼠骨髓瘤细胞系NS0，表达及纯化重组蛋白，获得包含小鼠TREM-1胞外结构域的重组蛋白。该蛋白虽然生物活性好，但重组蛋白含有大段的非小鼠TREM-1序列，而且产量低，纯化工艺复杂，成本高，不适合大批量生产。 

由于TREM-1蛋白在应用于治疗败血症的潜在价值。开发可大规模生产、便于纯化、生物活性高、成本低廉的小鼠TREM-1蛋白，具有重要的价值。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供了一种 TREM-1胞外域的原核表达菌株以及在治疗猪链球菌细菌感染引起的败血症中的应用。 

为实现上述目的，本发明所设计方案如下： 

将小鼠TREM-1胞外域编码基因的C端融合有FLAG标签，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1。将所述基因片段连接入原核表达载体pET-28a(+)，构建成原核表达质粒pET-28a-TREM1-FH，将其转化大肠杆菌工程菌株BL21（DE3），构建表达小鼠TREM-1胞外域的原核表达基因工程菌株BL21/pET28a-TREM1。 

得到的TREM-1胞外域的原核表达菌株，命名为Escherichia coil BL21/PET28a-TREM1，其保藏编号为：CCTCC NO：M2013272。TREM-1胞外域的原核表达菌株已于2013年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学，武汉市武昌珞珈山，邮编430072。 

本发明还提供了TREM-1胞外域的原核表达菌株生产的TREM-1蛋白以及在制备治疗猪链球菌感染引起的败血症药品中的应用，其中，TREM-1胞外域重组蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.2： 

MAIVLEEERYDLVEGQTLTVKCPFNIMKYANSQKAWQRLPDGKEPLTLVVTQRPFTRPSEVHMGKFTLKHDPSEAMLQVQMTDLQVTDSGLYRCVIYHPPNDPVVLFHPVRLVVTKGSSDVFTPVIIPITRLTERPILITTKYSPSDTTTTRSLPKPTAVVSSPGLGVTIINGTDADSVSTDYKDDDDKLEHHHHHH。 

本发明优点如下： 

本发明通过基因工程技术首先在小鼠TREM-1胞外域编码基因的C端融合上FLAG标签(DYKDDDDK)，然后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a(+)，得到菌株BL21/pET28a-TREM1。因为该原核表达载体pET-28a(+)自带有HIS标签（HHHHHH），菌株BL21/pET28a-TREM1表达小鼠TREM-1蛋白胞外域时，TREM-1蛋白胞外域上同时携带有FLAG和HIS两个标签。 

利用IPTG诱导菌株BL21/pET28a-TREM1表达小鼠TREM-1蛋白胞外域，采用压力破碎的方法来裂解菌体，收集含TREM-1蛋白胞外域的包涵体。采用SKL法进行蛋白变性和低温透析复性处理，从而获得可溶性的重组小鼠TREM-1蛋白胞外域。应用FLAG亲和树脂（结合FLAG标签）和NTA树脂（结合HIS标签）对含有FLAG和HIS两个标签的蛋白进行纯化，并进行去内毒素处理。可以得到高纯度的TREM-1胞外域重组表达蛋白，其纯度高达90%以上。 

所获得的TREM-1胞外域重组表达蛋白制备简单，纯化效率高，适合大规模生产，成本相对较低。所获得TREM-1胞外域重组表达蛋白可显著抑制TREM-1信号通路。配合抗生素可显著提高猪链球菌感染引起的败血症的存活率。对于败血症的治疗具有很好的开发价值和意义。 

附图说明