[发明专利]改良的GRG23 EPSP合酶：组合物和使用方法

说明书

本申请为分案申请，原申请的申请日为2007年11月20日，申请号为200780049630.6（PCT/US2007/085164），发明名称为“改良的GRG23EPSP合酶：组合物和使用方法”。 

技术领域

本发明涉及植物分子生物学，特别是涉及新型EPSP合酶多肽，所述合酶多肽赋予增加的对除草剂草甘膦的抗性和耐性。 

背景技术

N-膦酰甲基甘氨酸，一般称为草甘膦，是重要的农学化学制品。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸（S3P）转化为5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。这种酶（5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，本文称为“EPSP合酶”或“EPSPS”）的抑制通过关闭莽草酸途径，从而抑制芳香族氨基酸的生物合成来杀死植物细胞。 

由于草甘膦类除草剂抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，而且也对细菌细胞具有毒性。草甘膦抑制多种细菌EPSP合酶，因而对这些细菌具有毒性。然而，某些细菌EPSP合酶对草甘膦具有高的耐性。 

可以通过转化植物细胞以表达抗草甘膦的细菌EPSP合酶来产生抗草甘膦毒性的植物细胞。值得注意，来自根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株CP4的细菌基因已经被用于在植物中表达之后赋予植物细胞除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）菌株CT7的突变EPSP合酶赋予细菌细胞草甘膦抗性，并且赋予植物细胞草甘膦抗性（美国专利第4,535,060、4,769,061和5,094,945号）。 

美国专利第6,040,497号报道了突变玉米EPSP合酶，其在102位具有苏氨酸到异亮氨酸的置换并且在106位具有脯氨酸到丝氨酸的置换（“TIPS”突变）。这样的改变赋予了玉米酶草甘膦抗性。来自鼠伤 寒沙门氏菌菌株CT7的突变EPSP合酶赋予细菌细胞的草甘膦抗性，并且据报道赋予植物细胞草甘膦抗性（美国专利第4,535,060、4,769,061和5,094,945号）。He等，((2001)Biochim et Biophysica Acta1568:1-6)已经通过在大肠杆菌（E.coli）和鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶基因之间进行诱变和重组而开发了具有增加的草甘膦耐性的EPSP合酶，并且提出在位置42（T42M）和位置230（Q230K）的突变可能是造成观测到的抗性的原因。后续工作（He等，(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67:1405-1409）显示，T42M突变（苏氨酸到甲硫氨酸）足以提高大肠杆菌酶和鼠伤寒沙门氏菌酶两者的耐性。由于除草剂抗性植物提供的许多优势，除草剂抗性基因改善的抗草甘膦活性是期望的。 

诱变的可选方法是“变换诱变（permutational mutagenesis）”方法，所述方法在2006年6月13日提交的美国专利申请第60/813,095号中被描述。 

发明内容

提供了赋予抗性或耐性的组合物和方法。组合物包括抗草甘膦除草剂的EPSP合酶，以及编码这种酶的核酸分子，包含那些核酸分子的载体和包含这些载体的宿主细胞。组合物包括编码除草剂抗性多肽的核酸分子，其包括编码包含SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的多肽的那些核酸分子，以及SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。编码序列可以在DNA构建物或表达盒中使用，用于在生物体——包括微生物和植物——中转化和表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子，它们通过将本发明的组合物引入到生物体的基因组中而具有草甘膦抗性。在所述生物体是植物时，序列的引入允许含草甘膦的除草剂应用到植物以选择性地杀死对草甘膦敏感的杂草或其它未转化的植物，但是不杀死转化的生物体。该序列可以另外用作标记，用于选择在草甘膦条件下生长的植物细胞。 

另外提供了鉴定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括在本发明的结构域存在的基础上鉴定对草甘膦具有抗性的另外的EPSP合酶序列。 

附图说明

图1显示GRG23(ace1)(“M5”，SEQ ID NO:10)在37℃0至25小时相比于野生型GRG23(“WTGRG23”，SEQ ID NO:2)的酶促活性。