[发明专利]分泌表达外源蛋白的酵母转化子及其制备方法

权利要求书

1.一种分泌表达外源蛋白的酵母转化子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计克隆外源基因CDS的引物：正向引物的5’端引入XhoI位点，并在对应于Kex2蛋白酶识别区域的P1’位点分别引入20种天然氨基酸的密码子，反向引物的5’端引入NotI位点，得20对系列引物；

（2）TA克隆感兴趣的外源基因CDS：以含有步骤（1）所述20对系列引物感兴趣的目标基因完整CDS序列的cDNA或者DNA为模板，用步骤（1）所述系列引物扩增出完整的CDS基因片段，回收PCR产物TA连接入TA克隆载体pMD20-T，得到系列P1’变化载体群P1’-CDS-pMD20-T，经过测序验证所有载体P1’位点氨基酸密码子与设计相同，且外源基因CDS确定为正确的可表达序列；

（3）亚克隆构建酵母真核表达载体群：将步骤（2）所得的载体群P1’-CDS-pMD20-T和酵母表达载体pPICZαA，分别经XhoI和NotI双酶切消化并回收，用Solution I连接试剂连接，得系列P1’变化载体群P1’-CDS-pPICZαA；

（4）转化重组载体群至酵母宿主中：将步骤（3）所得的系列P1’变化载体群P1’-CDS-pPICZαA经SacI单酶切线性化后，回收酶切产物，再经氯化锂转化法转入毕赤酵母Pichia pastoris的X-33宿主菌中，经zeocin90-110μg/ml筛选得到阳性转化子；

（5）确定酵母转化子拷贝数：将步骤（4）所得的阳性转化子转接到含zeocin浓度递增的YPD平板，获得具有相同外源基因整合拷贝数的转化子群P1’-CDS；

（6）酵母转化子的液体培养及甲醇诱导表达：将步骤（5）所得的有相同外源基因整合拷贝数的转化子群P1’-CDS及空载转化子接种至BMGY培养基，25-30℃摇床培养至OD₆₀₀为1.8-2.2，收集酵母细胞用BMMY培养基重悬，稀释至OD₆₀₀为0.9-1.1，甲醇诱导110-130h，离心并收集上清；

（7）筛选表达水平最高的重组载体转化子：通过分析步骤（6）所得的上清中外源重组蛋白产量，即得表达水平最高的P1’氨基酸的重组载体转化子。

2.根据权利要求1所述的分泌表达外源蛋白的酵母转化子的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述20种天然氨基酸的密码子的正向引物分别为：

SEQ ID NO.1：

Glu：5’-CTCGAGAAAAGAGAA-CDS-3’；

SEQ ID NO.2：

Ala：5’-CTCGAGAAAAGAGCT-CDS-3’；

SEQ ID NO.3：

Arg：5’-CTCGAGAAAAGAAGA-CDS-3’；

SEQ ID NO.4：

Asn：5’-CTCGAGAAAAGAAAC-CDS-3’；

SEQ ID NO.5：

Asp：5’-CTCGAGAAAAGAGAT-CDS-3’；

SEQ ID NO.6：

Cys：5’-CTCGAGAAAAGATGT-CDS-3’；

SEQ ID NO.7：

Gln：5’-CTCGAGAAAAGACAA-CDS-3’；

SEQ ID NO.8：

Gly：5’-CTCGAGAAAAGAGGT-CDS-3’；

SEQ ID NO.9：

His：5’-CTCGAGAAAAGACAT-CDS-3’；

SEQ ID NO.10：

Ile：5’-CTCGAGAAAAGAATT-CDS-3’；

SEQ ID NO.11：

Leu：5’-CTCGAGAAAAGACTT-CDS-3’；

SEQ ID NO.12：

Lys：5’-CTCGAGAAAAGAAAA-CDS-3’；

SEQ ID NO.13：

Met：5’-CTCGAGAAAAGAATG-CDS-3’；

SEQ ID NO.14：

Phe：5’-CTCGAGAAAAGATTT-CDS-3’；

SEQ ID NO.15：

Pro：5’-CTCGAGAAAAGACCA-CDS-3’；

SEQ ID NO.16：

Ser：5’-CTCGAGAAAAGATCT-CDS-3’；

SEQ ID NO.17：

Thr：5’-CTCGAGAAAAGAACT-CDS-3’；

SEQ ID NO.18：

Trp：5’-CTCGAGAAAAGATGG-CDS-3’；

SEQ ID NO.19：

Tyr：5’-CTCGAGAAAAGATAT-CDS-3’；

SEQ ID NO.20：

Val：5’-CTCGAGAAAAGAGTT-CDS-3’。