[发明专利]热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲酸脱氢气酶突变体，特别涉及一种热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法。

背景技术

氧化还原酶在制备手性醇、氨基酸及羟基酸等方面的应用越来越多。但在其催化的反应中，90％需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH），或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，NADPH）做为辅酶。因为在氧化还原酶的应用中，还需要低成本、高效的辅酶再生体系。甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase，FDH）是最成功的辅酶再生体系之一，已应用于工业生产中。其优势在于反应不可逆，并只产生一种副产物－二氧化碳，对酶的活性没有任何影响。Kula等在2002年因为发现这一体系而被授予德国未来奖。但目前发现的FDH热稳定性较差，在55℃－60℃之间迅速失活。

发明内容

本发明的目的是提供一种与野生型甲酸脱氢酶相比热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体、编码序列及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体，其源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的野生型甲酸脱氢酶，能够催化辅酶NADH循环再生。所述甲酸脱氢酶突变体，与SEQ ID NO.2的野生型甲酸脱氢酶相比表现出更强的热稳定性。甲酸脱氢酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

上述甲酸脱氢酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变：I98V，V152I，A154D，D158R。

上述甲酸脱氢酶突变体，优选自序列SEQ ID NO.4。全长突变的甲酸脱氢酶对于保持酶的活性和热稳定性并不是必需的。相应地，应考虑甲酸脱氢酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的甲酸脱氢酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中甲酸脱氢酶突变体(或其片段 )诸如通过助溶标签 (如SUMO蛋白 )、纯化标签 (如结合金属的 His标签 )和细菌定位信号 (如分泌信号 )的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。

上述甲酸脱氢酶突变体，其甲酸脱氢酶比野生型甲酸脱氢酶具有更好的热稳定性。

本发明提供一种编码甲酸脱氢酶突变体的基因，其优选自SEQ ID NO.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。

本发明提供一种重组质粒，其源自SEQ ID NO.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌 lacUV5操纵子、大肠杆菌 trp操纵子、大肠杆菌 tac操纵子等。

本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达甲酸脱氢酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过recombineering重组工程使载体整合到基因组中。

本发明提供一种制备甲酸脱氢酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)构建表达甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及甲酸脱氢酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备甲酸脱氢酶突变体。