[发明专利]中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I及其分离纯化方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于中药中天然药物技术领域，涉及中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I及其分离纯化方法和应用。

背景技术

统计资料表明，我国从上世纪80年代起，恶性肿瘤的发病率呈明显上升趋势，常见肿瘤的发病率以5-10%的速度增长，每年恶性肿瘤发病人数为160万，每年死于恶性肿瘤的患者为130万人，目前肿瘤病人的数目在540万。大中城市中肺癌、乳腺癌发病率最高；农村地区则以胃癌、食管癌发病率最高。可见，我国抗肿瘤药的市场潜力巨大。治疗恶性肿瘤的相关研究工作正在不断取得进展，WHO公布的常用抗肿瘤药物为49种。由于抗肿瘤药物的研发周期长，国内大部分企业产品目前仅是仿制国外上市品种，有自主知识产权的国产抗肿瘤药物亟待开发。

海葵（sea anemone）又名海菊花,属腔肠动物门（Coelenterata）珊瑚虫纲（Anthozoa）海葵目（actiniaria）动物。广泛分布在热带和温热带海域，主要固着在海中岩石上或泥沙中，我国海域分布的海葵有黄侧花海葵（Anthopleura xanthogrammica）、太平洋侧花海葵（A.pacifica）、纵条矶海葵（Haliplanella luciae Hand）、中华仙影海葵（Cereus sinensis Verrill）等。海葵具有滋阴壮阳、收敛止泻、燥湿杀虫等功效，民间主要用来治疗痔疮、脱肛、饶虫病和体癣等。现代研究表明从海葵中分离得到的溶细胞毒素多具有较强的抗肿瘤活性，比如StI、EqtII、EqtIIA179C、EqtIIK20C和EqtIIR126C等对不同的肿瘤细胞都具有较强的抑制作用。我国沿海海葵资源丰富，特别是随着江苏省海洋水产研究所对中华仙影海葵进行人工繁育并养殖成功，这使得利用海葵资源进行产业化综合开发成为可能，中华仙影海葵（Cereus sinensis Verrill）隶属于绿海葵科仙影海葵属，是我国沿海广泛分布的一种可食用有毒海葵，其溶细胞毒素的分离纯化、组成及性质研究尚未见报道。

海葵毒素的分离纯化难度较大，其主要原因有以下几个方面：第一，海葵粗毒中含有许多种蛋白成分，其中一些蛋白间的性质（如：分子量、等电点、疏水性等）很接近；第二，海葵毒素多为蛋白类物质，容易受到外界环境因素变化的影响而致使其活性降低甚至丧失；第三，不同种海葵，由于其生长环境等的不同，导致其生理结构及体内所含有毒素成分和性质也存在较大差异，这也使得不同种海葵毒素的分离纯化工作很难直接效仿，而只能通过繁琐的实验摸索才可能获得。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离纯化方法。

本发明的另一目的是提供该方法分离纯化获得的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I。

本发明的又一目的是提供中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的应用。

中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离方法，主要包括以下步骤：

1）将中华仙影海葵触手粗毒液经硫酸铵分段盐析沉淀后，得到0-40%、40%-60%和60-90%三个硫酸铵饱和度段，然后用pH=7.0含0.15mol·L^-1氯化钠的10mmol·L^-1PBS缓冲液复溶，待用；

2）将上述60-90%硫酸铵饱和度段沉淀复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，采用洗脱液以0.5mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，收集的洗脱液在4℃条件下用3kDa的超滤管进行浓缩，收集峰1浓缩液待用；所述洗脱液为pH=7.0含0.15mol·L^-1氯化钠的10mmol·L^-1磷酸缓冲液；

3）取上述步骤2）中峰1浓缩液经凝胶色谱柱superdex75采用洗脱液以流速0.3mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，收集的洗脱液在4℃条件下用3kDa的超滤管进行浓缩，收集活性峰1浓缩液，并用3.5kDa透析袋过夜透析，透析袋外液为纯水，冷冻干燥后，得所述的溶细胞多肽CCT-I；所述洗脱液为pH=7.0含0.15mol·L^-1氯化钠的10mmol·L^-1PBS缓冲液。