[发明专利]一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的筛选方法，特别涉及一种卤醇脱卤酶的筛选方法。

背景技术

卤醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase,HHDH）是一种具有催化活性的水解酶，能够可逆性作用于邻羟基卤化物（邻卤醇）形成环氧化物及环氧化物的开环。

环氧化物被公认为有机合成中最重要、应用最广泛的合成中间体之一，环氧化物手性合成和开环对于手性药物的合成非常重要。例如阿托伐他汀钙的侧链中间体A5（(R)‐4‐氰基‐3‐羟基丁酸乙酯）的酶法合成中，就是利用卤醇脱卤酶作为生物催化剂。

天然的卤醇脱卤酶在工业化过程中存在生产成本高、酶活低、稳定性差等现象，制约了这类酶在大规模生产中的应用，通过筛选得到高酶活的卤醇脱卤酶是降低生产成本的重要方法之一。定点突变在卤醇脱卤酶的改造中扮演着重要的角色，通过此手段已对该类酶的某些特性如稳定性、转换数及对应体选择性等进行了改造，并获得了一些好的突变体。但该方法存在筛选容量过大、筛选过程复杂，且费用昂贵、费时费力等特点。

目前，卤醇脱卤酶的筛选主要利用气相色谱（GC）检测产物的生成量来计算酶活的值，从而筛选到酶活较高的卤醇脱卤酶，如专利US7588928中，就是用这种方法进行筛选的。但在筛选过程中由于突变体很多，使用的仪器和检测费用昂贵、过程复杂且费时费力，不利于大规模的推广使用。

在利用卤醇脱卤酶催化的过程中，反应体系中由于有HCl的生成，pH会逐渐减小，pH的变化速率与反应的快慢有直接的关系，在相同条件下，而反应的快慢与酶活的大小直接相关。因此，可以利用反应体系pH的变化速率来快速筛选具有高酶活的卤醇脱卤酶。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有筛选卤醇脱卤酶的方法成本高及工作量大和周期长的不足等问题。

实现本发明目的的技术方案是本发明提供了一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法，是基于深孔板的微型化培养与基于pH耦联变化的筛选方法。具体的方法如下：

取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落，经稀释菌浓度后接种于装有液体培养基的深孔板的孔中，每个孔有一个特定的编号；于30～40℃温度下，180～220rpm的摇床中培养4～10h；然后加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），于28～35℃温度下、180～220rpm的摇床中继续培养10～20h；将深孔板重复进行超低温冷冻后室温融化；将深孔板离心处理5～30min；深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液稀释待测。取反应管，加入反应底物，去离子水和pH指示剂，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作为对照，于30～70℃水浴中反应10～30min，根据反应过程中体系颜色的变化情况进行初筛，根据初步测定结果，选择对应的克隆进行摇瓶复筛，复筛时在反应体系中加入反应底物、去离子水，用pH计在线监测体系的pH变化，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作对照，于30～70℃水浴反应10～30min，根据反应过程中体系pH变化速度的快慢筛选出高酶活的卤醇脱卤酶。

初筛时，反应初时体系的颜色为蓝紫色，随着反应的进行，pH下降，体系的颜色由蓝紫变为紫色，后来变为黄色。筛选出比对照颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落进行复筛。

复筛：在初筛出的卤醇脱卤酶单菌落中筛选出，在复筛开始后单位时间内pH变化量比作为对照的原始的卤醇脱卤酶快的卤醇脱卤酶单菌落，即为高酶活的卤醇脱卤酶。

本发明进一步的方案：

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落，适当稀释菌浓度，接种于装有液体培养基的深孔板的孔中，每一孔由板号、行号和列号的组合标记，使每个孔有一个特定的编号。盖上深孔板的三明治盖子，于30～40℃、180～220rpm摇床培养4～10h。加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），于28～35℃、180～220rpm摇床继续培养10～20h。结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱，待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化，然后再按以上过程2遍或2遍以上冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机，5000～10000×g离心5～30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释。在反应管中加入反应底物、去离子水和pH指示剂，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作对照，于30～70℃水浴反应10～30min，根据反应过程中体系颜色的变化情况进行筛选，根据初步测定结果，选择对应的克隆进行摇瓶复筛，获得高酶活的卤醇脱卤酶。