[发明专利]库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种库蚊黄病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针是根据库蚊黄病毒E基因区段的保守区域设计。试剂盒中包括的上游引物：5'‑CACGCCGAACGGACTTCT‑3’，下游引物：5’‑TCCATTGGCCGCCATATATC‑3’、TaqMan探针序列：5'‑TTTCGCACCGGAGCAGCCG‑3’，5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团，扩增的目前片段长度为62bp。该试剂盒可用于检测库蚊黄病毒，具有良好的灵敏度性和特异性，能检测到库蚊黄病毒的最低病毒滴度为10PFU/反应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及库蚊黄病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

库蚊黄病毒(Culex flavivirus，CxFV)是一种蚊传虫媒病毒，属黄病毒科黄病毒属，于2003年由日本学者在淡色库蚊(Culex pipiens)和三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)中首次分离到病毒，随后相继在印度尼西亚、美国、西印度群岛特立尼达、非洲乌干达、南美洲秘鲁、巴西、台湾地区和我国的山东省、辽宁省等地的多种库蚊属蚊虫中分离到该病毒。随着近年CxFV在全球不同地区的陆续发现，可以将CxFV分为两种基因型，在两种型别内均存在致细胞病变和非致细胞病变两种表现型。

目前，对蚊虫中CxFV的检测主要采用病毒分离和病毒核酸的普通PCR检测。病毒分离耗时且无法用于非致病变表型CxFV的检测，普通PCR快捷特异，但易造成污染且检测敏感性低。TaqMan Real-time PCR是一种实时荧光定量的检测方法，通过检测体系中荧光强度的动态变化对核酸进行定性、定量分析体外扩增技术。本研究利用TaqMan Real-time PCR技术建立了针对CxFV特异、快捷、敏感、有效的分子检测方法，为媒介中CxFV的监测与检测提供了技术支持。

发明内容

本发明提供了针对库蚊黄病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据库蚊黄病毒E基因区段最为保守的保守区域设计的，即可用于检测库蚊黄病毒，也可用于定量检测样本中库蚊黄病毒的核酸拷贝数。

所述引物与探针序列分别为：库蚊黄病毒上游引物：CxFV-E-F：5’-CACGCCGAACGGACTTCT-3’；下游引物：CxFV-E-R：5'-TCCATTGGCCGCCATATATC-3’；TaqMan探针：CxFV-E-Probe：FAM5’-TTTCgCACCggAgCAgCCg-3’TAMRA，5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。

所述库蚊黄病毒25uL实时荧光定量RT-PCR检测反应体系，包括：2×ReactionMix12.5μL、Enzyme Mix1μL、10μM上下游引物与5μM探针各1μL、RNA模板1μL、Nuclease-free water7.5μL。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系的最佳扩增条件为：先45℃10min；然后95℃10min；最后95℃15s和60℃60s40个循环。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有荧光定量PCR反应仪。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应构建的病毒数定量分析模型最低检测限为10PFU/反应。

所述库蚊黄病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应通过与普通PCR检测方法对蚊虫标本的检测应用比较，结果显示该方法具有较常规PCR检测法更加敏感、特异、简便和不易污染的特征。

附图说明

图1为对库蚊黄病毒的特异性检测的扩增曲线；