[发明专利]一株H9N2型禽流感毒株在疫苗开发上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株的分离与鉴定及利用该毒株制备用的预防禽流感的灭活疫苗。 

技术背景

禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科流感病毒属成员。根据流感病毒的核蛋白和基质蛋白的不同，可分为A、B、C三种血清型。禽流感病毒属于A型流感病毒。A型流感病毒粒子呈球形，直径100nm左右。病毒具有囊膜，囊膜上有12～14nm的纤突，有两种不同类型即HA和NA。病毒的核衣壳呈螺旋对称，核酸为单股负链RNA，可分成8个片段，总长约13.6kb。禽流感病毒的囊膜表面具有血凝素(HA)，能够凝集多种动物的红细胞，并且能被特异的抗血清所抑制。AIV根据其致病性可分为高致病性AIV和低致病性AIV，感染家禽的高致病性和低致病性AIV分别以H5和H9为主。 

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在，是当前禽流感流行的主要型别之一。H9N2亚型禽流感最早在北美的火鸡体内被发现，1994年我国家禽中开始出现。此型禽流感呈地方性流行、持续存在等特征，严重危害我国养禽业的发展，造成了巨大的经济损失。H9N2属于低致病性禽流感毒株，感染后并不一定造成禽群的大规模的死亡，但会使禽群的免疫力下降，对各种病原的抵抗力降低，常常易发生并发或继发感染。H9N2的感染主要引起呼吸道感染或产蛋率下降等症状，当伴有其他病原感染后，主要引起青年鸡、产蛋鸡的呼吸道、生殖道、肾或胰腺的严重损伤。所以低致病性的禽流感同样对养禽业存在着严重的威胁。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践表明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用，所以选择免疫保护力好的H9N2禽流感病毒疫苗株，才能使得疫苗的免疫效果得到保证。 

发明内容

本发明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株的分离与鉴定及利用该毒株制备用的预防禽流感的灭活疫苗，所制备的疫苗是针对禽H9N2亚型流感病毒的疫苗。 

禽H9N2亚型流感病毒已于2012年1月9日由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定，命名为禽流感A型流感病毒H9N2亚型。该毒株于2012年10月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.6659。禽流感A型流感病毒H9N2亚型CGMCC No.6659简称为AIV-JD株。 

本发明中制备禽流感病毒疫苗，其有效成分为灭活后的AIV-JD株病毒。所制备的疫苗是针对禽H9N2亚型流感病毒的疫苗。所述禽流感疫苗的制备方法包括AIV-JD株病毒液的灭活终浓度0.2％的甲醛，37℃灭活24h，灭活液与新型605佐剂4∶6的混合，得到禽流感病毒灭活苗。 

本发明中制备禽流感疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的禽流感灭活疫苗疫苗对禽具有很好的保护力。 

具体实施方式

实施例1 

AIV-JD株的分离与鉴定 

1.病毒分离 

将采集的喉头、气管和肺脏混合、剪碎、研磨，按W/V为1∶5比例用无菌PBS稀释，4000rpm离心10min，取上清液过滤，经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚。鸡胚接种后置37℃孵化器继续孵化，孵育24h后观察鸡胚存活情况，24小时内死亡鸡胚视为非特异死亡，弃去不用，连续孵化96小时，收获尿囊液。 

2.病毒的鉴定 

2.1血凝试验(HA) 

将收集的尿囊液作为被检样品，进行HA试验，观察凝集反应，试验设PBS阴性对照。血凝价大于1∶16判定为阳性。结果显示，鸡胚尿囊液对1％鸡红细胞的凝集效价为1∶1024。 

2.2血凝抑制试验(HI) 

根据凝集试验的测定结果，用灭菌PBS配制4个工作单位的抗原。用PBS(pH7.0～7.2)分别将禽流感H1～H16亚型、新城疫阳性血清及SPF鸡阴性血清做连续倍比稀释后，做HI试验。结果表明，分离毒株禽流感H1～H8和 H10～H16及新城疫阳性血清、阴性血清均没有交叉反应，而与H9亚型禽流感抗血清有交叉反应(1∶256)。 

2.3病毒神经氨酸酶活性测定(NA)