[发明专利]用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒有效
申请号: | 201310324354.7 | 申请日: | 2013-07-30 |
公开(公告)号: | CN103361445A | 公开(公告)日: | 2013-10-23 |
发明(设计)人: | 潘艳;李军;杨威;陈泽祥;彭昊;许力干;马春霞;胡帅;禤雄标;柳峰;谢永平 | 申请(专利权)人: | 广西壮族自治区兽医研究所 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
代理公司: | 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 | 代理人: | 杨立华 |
地址: | 530001 广西*** | 国省代码: | 广西;45 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 检测 狂犬病 病毒 lamp 引物 及其 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及狂犬病病毒检测技术领域,尤其涉及用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒。
背景技术
狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的人畜共患传染病,它可以感染所有的温血动物,一旦发病100%死亡。过去几十年来,尽管疫苗研究以及狂犬病的防治工作已经取得了很大进展,但全世界范围内每年因狂犬病而死亡的病例仍达到4000-70000例。非洲和亚洲是狂犬病流行的主要区域,在该地区狗是病毒最主要的宿主,也是引起人死亡的主要原因。狂犬病也是我国的主要公共卫生问题,近年来我国狂犬病的发病和死亡人数位居全球第二,仅次于印度。据卫生部报道,过去60年间(1950-2010)我国因狂犬病而死亡的人共有124255人,平均每年死亡人数为2037人。
目前,狂犬病病毒的检测方法有:荧光抗体试验(Fluorescent Antibody Test,FAT)、快速狂犬病酶免疫诊断法(Rapid Rabies Enzyme Immunodetection,RREID)、小鼠颅内接种分离狂犬病毒法(Mouse injection test,MIT)、细胞培养分离技术(Cell culture Isolation Techniques,CIT)、RT-PCR、荧光定量PCR等。其中,FAT需要荧光显微镜,且荧光阳性和阴性不易辨认,需要有经验的操作人员。MIT和CIT耗时很长,并需要配合FAT技术才能判定结果。RREID和胶体金免疫层析法简单、快速,但灵敏度不够,对于动物咽拭子等病毒含量较少的样品,检出率难以达到要求。殷相平等建立的RT-PCR技术在狂犬病的分子生物学诊断上应用得最多最普遍,其特点是敏度高、特异性强,适合于实验室应用,但需要特定仪器,耗时较长。由于诊断仪器设备的缺乏,基层防疫机构难以进行狂犬病病毒的检测。鉴于狂犬病的危害性,急需建立一种快速检测方法适用于临床诊断。
Notomi等在2000年报道了一种新的DNA扩增技术—环介导等温扩增技术。该技术具有方法简单、快速、特异性强的特点,而且反应时间短,不需要PCR仪,肉眼即可判断结果。该技术中所用到的LAMP方法检测需1小时后加入染料才能判断结果,反应中加入的荧光染料syber-green,需采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像,存在开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染,缺乏对反应的实时监控,很难排除干扰因素,难以对检测结果做出准确的判定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒,以满足基层现场快速检测狂犬病病毒的需要。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案:用于检测狂犬病病毒的LAMP引物,包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LF,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.5的碱基序列。
用于检测狂犬病病毒的LAMP试剂盒,该试剂盒含有以下试剂:反应缓冲液、酶溶液、去离子水、荧光目视检测试剂及狂犬病病毒模板(阳性对照),反应缓冲液中含有LAMP引物,LAMP引物包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LF,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.5的碱基序列。
反应缓冲液为2×反应缓冲液,12.5μl反应缓冲液中含有外引物F3和B3各5pmol、内引物FIP和BIP各40pmol及环引物LF20pmol。
荧光目视检测试剂为钙黄绿素荧光染料,荧光染料在反应前加入,荧光可视化检测在63℃下反应12~30min。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据狂犬病病毒ERA株的L基因设计了两个特异性外引物F3和B3、两个特异性内引物FIP和BIP和一个特异性环引物LF,由此发明了用于检测狂犬病病毒的LAMP试剂盒。应用本发明的LAMP试剂盒建立狂犬病病毒检测方法,仅需通过对组织样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增,即可检测出狂犬病病毒,方便基层快速、准确、简便地进行狂犬病诊治。本发明具有以下突出优点:
<1>特异性强
实验证明,应用本发明阴性对照株均无阳性结果出来,与PCR检测结果一致。
<2>灵敏度高
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