[发明专利]一种鉴定乳鸽性别的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定乳鸽性别的PCR方法。

背景技术

鸽子是一种单态性鸟类，即无论是雏鸽还是成年鸽都很难从外观形态或其他行为上区分雌雄性别。用于鸽子性别鉴定的传统方法主要有翻肛法、腹腔镜检法、体尺测量法和粪便类固醇检测等，但这些方法或费时费力或有较大伤害性，准确度不高，难以对肉鸽这种繁殖量大的鸟类进行性别鉴定。本方法利用鸽子性染色体上的CHD基因（chromobox-helicase-DNA binding gene全称为染色体螺旋蛋白基因）在Z、W染色体上长度及同源序列的差异，雌鸟中有两个同源拷贝CHD-Z（长370bp，GenBank:GU289184.1）和CHD-W（长350bp，GenBank:GU289183.1），在雄鸟中只有CHD-Z，运用PCR扩增和琼脂糖凝胶分离CHD-Z、CHD-W从而达到对鸽子进行性别鉴定目的，是一种准确性高、简便、成本低、零污染并且对动物伤害极小的性别鉴定方法。

在性别鉴定的过程中，获取用于PCR扩增的DNA模板有很多种，主要有两种取样方法，即伤害性取样和非伤害性取样（Tabertlet et al,1999）。伤害性取样指的是通过杀死、伤害动物来获得血液、肌肉等组织样品；非伤害性取样指的是不采用杀死、伤害动物的方式，而是捕捉动物进行血液的抽取以及毛发或羽毛等样品的采集(Taberlet et al,1999；Morin and Woodruff,1996)。

在鸽子的实际养殖过程中，我们发现鸽子有时会存在同性恋的现象，且两只雌鸽子在一起可以产生无精蛋。近年来，由于鸽子蛋的高营养价值和药用价值越来越受到消费者的青睐，因此鸽子蛋的市场价格也有走高的趋势，目前大约3元一枚；由于鸽子的单态性，23日龄的雌雄乳鸽在体型和外貌上难以区分。23日龄的乳鸽在体型和外貌和50日龄的乳鸽没有太大区别，在这两个日龄的乳鸽售价相同，鸽子的23日龄至50日龄之间需要消耗饲料成本、人工成本、管理成本等，因此厂家为了追求最大的经济效益，一般会在乳鸽23日龄时留母售公，所以，对23日龄前的乳鸽进行性别鉴定具有重要实践意义和经济价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术的问题，本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定乳鸽性别的引物对。本发明的第二个目的是提供一种鉴定乳鸽性别的PCR试剂。本发明的第三个目的是提供一种鉴定乳鸽性别的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于鉴定乳鸽性别的引物对，如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

一种鉴定乳鸽性别的PCR试剂，由所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶、10*PCR缓冲液和镁离子组成。

所述引物对中各引物在所述的PCR试剂中的浓度均为0.2μM，所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度1mM，所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0.05IU/μl，所述镁离子在所述的PCR试剂中的浓度为2.0mM。含有所述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

所述的引物对、所述的试剂或所述试剂盒在鉴定乳鸽性别中的应用。

一种鉴定乳鸽性别的方法，包括以下步骤：用所述的引物对或所述的试剂或所述的试剂盒中的引物对对待鉴定乳鸽的羽毛毛球基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小分别为338bp和318bp的片段，则所述待鉴定乳鸽为雌性，若所述PCR扩增产物中含有大小为338bp的片段而且不含有大小为318bp的片段，则所述待鉴定乳鸽为雄性。

所述羽毛毛球基因组DNA的提取方法如下：1）：毛球DNA提取缓冲液终浓度配比：KCl50mM；Tris-HCl(pH8.3)10mM；MgCl₂2.0mM，蛋白酶K20μg/ml；2）羽毛毛球样本处理：样本采集到达实验室后，立即用手术刀切1～1.5mm的毛球薄片，放入事先加入90μL上述毛球DNA提取缓冲液的96孔PCR板中，毛球薄片集满一板96个样品后，3000转/分钟，离心2分钟；3）消化灭活：用PCR仪65℃60分钟消化，95℃，15分钟灭活蛋白酶K，3000转/分钟，离心2分钟，上清即为羽毛毛球基因组DNA，取上清1.2μl用于PCR扩增，其余贮存在-20℃备用。

所述PCR扩增中，以待鉴定乳鸽的羽毛毛球基因组DNA为DNA模板；所述PCR扩增的退火温度为55℃。