[发明专利]猪肝脏特异性表达基因TTR启动子的克隆及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪骨骼肌特异性表达基因TTR启动子区域的分离鉴定及功能验证。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，可与众多的转录因子相互作用调控基因的表达(武力1999)。因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等有利于我们更好的理解相应基因的功能及基因间的互作关系。

启动子分类方法较多，根据启动子的功能及作用方式可以分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子；根据启动子的结构及位置可以分为核心启动子、近端启动子及远端启动子（Wang and Hannenhalli2006;Reddy et al2003;Aneja et al2008）；根据核心启动子的结构又可以分为集中型启动子和分散型启动子。尽管启动子的分类多种多样，对于真核生物而言，RNA聚合酶II型启动子起着主要作用（Sandelin et al2007）。在组织特异性启动子调控的基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特征。具备高转录活性的组织特异性启动子是基因工程中的理想启动子，这类启动子既能高效启动外源基因表达，又能使外源基因在特定的靶细胞或靶组织中表达，这比现阶段广泛利用的CMV和SV40启动子更具有研究和实用价值。

组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病治疗方面的前景尤其可观。其次，转基因动物育种研究中，通过组织特异性启动子调控外源目的基因在靶组织中表达，能够有效改善动物的某些性状，如肌内脂肪；或改善动物的消化系统以减少排泄物中的氮磷含量等。鉴于此，组织特异性启动子在基因工程和转基因育种中越来越受到研究者的青睐。

TTR基因，翻译为甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)又称为前白蛋白(prealbumin，PA)，VA运转蛋白，分子质量约为54ku，主要由肝细胞合成(Zeledon et al2006)，甲状腺素运载蛋白90％是由肝脏产生，而后分泌到人脑脊液和血液(Chen et al2005)，脉络膜丛及视网膜也产生此蛋白质的小片段。

到目前为止，未见到研究猪肝脏肌特异性表达基因TTR的启动子功能的相关报道。所以申请人对这个基因进行了启动子的功能研究，以期能够更好地利用该启动子。

发明内容

本发明的目的在于分离克隆猪的肝脏特异性表达基因TTR启动子区域，并对其进行功能验证,以期获得此基因的具备较高启动活性并保持肌肉组织特异性的调控序列，为动物基因工程提供可利用的组织特异性启动子。

本发明从大白猪的基因组中分离并鉴定出TTR基因具有肝脏组织特异性的启动子。以大白猪的血液基因组DNA为模板扩增获得了2185bp长度的启动子片段，将该片段融合报告基因萤火虫荧光素酶基因（简称LUC基因）构建pGL3-TTR-pro真核表达载体，将这些载体分别转染C2C12、3T3-L1及Hepa1-6细胞，通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对活性，从而获得保持肝脏组织特异性的启动子区，进一步构建该启动子与BGL1基因的重组载体，BGL1基因来自于扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的基因组，通过RT-PCR检测BGL1的表达量。

具体地，本发明通过以下技术实现：

本发明的技术路线见图1所示。