[发明专利]一种Asia1型口蹄疫病毒抗原及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗原，具体地，涉及一种融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒抗原的制备和应用。 

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽(Snowdon et al,1968)，虽然该病的致死率不高，但引起动物生产性能下降，而且该病的暴发影响国际贸易，往往造成惨重的直接及间接经济损失。 

目前对口蹄疫的防制主要采取免疫与扑杀相结合政策(Aggarwal et al,2002)，而安全有效的疫苗是成功防制乃至最终消灭口蹄疫的先决条件。口蹄疫弱毒疫苗有较好的免疫力，免疫持续时间长，疫苗接种量少，但弱毒疫苗存在散毒和毒力返祖现象，国际上已有多起由于使用弱毒疫苗而引发口蹄疫的报道(Beck et al,1987)，因此，许多国家已明文禁止使用弱毒疫苗。灭活疫苗虽克服了弱毒疫苗的一些缺点，但疫苗接种剂量较大，免疫持续期短；疫苗中未完全灭活的病毒可能引起疾病的新爆发；此外灭活疫苗诱导的抗病毒免疫机制的广谱性有限，其局限性日渐突出(Chan et al,2000)，因此，世界各国的相关研究室都在致力于研制安全、有效的新型口蹄疫疫苗。 

近年来，基因工程技术及免疫学的快速发展为口蹄疫新型疫苗的研制提供了条件，新型疫苗主要指基因工程技术生产的疫苗，包括亚单位疫苗、多肽疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗及抗独特型抗体疫苗，但是上述新型疫苗由于其免疫效果和生产成本远不及传统疫苗，迄今没有成熟的产品投放市场。而植物表达系统不仅能进行正确的翻译后加工，可直接食用，易获得多价疫苗，而且廉价安全不需特殊的运输和储藏条件，因此被认为是一个比微生物或动物更理想的蛋白生产系统 (Schuyler et al,2002; Lauterslager et al,2002)。 

抗原表达量低是制约植物基因工程疫苗发展的瓶颈。对抗原基因的密码子按照植物密码子进行优化，表达包含病毒全部抗原位点是最普遍可行的提高蛋白免疫原性的办法。此外，研究表明大肠杆菌热敏肠毒素 ( LT ) 已被证实是强有力的黏膜免疫佐剂，但因其毒性而在应用上受到限制。完整的LT分子由1个A 亚单位(LTA) 和5个B 亚单位(LTB) 组成，A 亚单位具有ADP2核糖基化转移酶活性, 也是毒素毒性所在部位；B亚单位能与哺乳动物细胞表面神经节苷酯GM1结合, 具有粘膜佐剂活性，通过口服能使机体产生很高的抗体效价，可用于强化多糖和蛋白质等半抗原。大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LTB）基因由375bp构成，LTB与其它抗原的融合蛋白是将佐剂和抗原连接起来，靶向性更强，可增强抗原的免疫原性，是理想的疫苗佐剂。因此，为了使FMDV抗原基因在真核植物体内有效表达，在不改变病毒抗原蛋白氨基酸序列的前提下优化改造密码子，人工合成了Asia1型FMDV VP1基因及LTB基因，将VP1基因片段置于LTB基因的3‘端，并保证同一阅读框架，构建了表达LTB-Asia1/VP1融合蛋白的重组质粒，作为连接的Linker，在LTB和VP1序列连接处设计了一个空间活动性较大的连接肽（linker序列），可保持LTB和VP1两个序列表达蛋白分子的天然构象，有利于二者功能的正常发挥。通过农杆菌介导法将重组质粒转化番茄子叶，筛选出能够表达目的蛋白的转基因植株，通过对豚鼠免疫后抗强毒攻击试验检测口蹄疫转基因疫苗的免疫效果，为将其应用于FMD基因工程疫苗的研究奠定基础。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种通过直接食用FMD转基因植物对动物进行免疫的Asia1型口蹄疫病毒抗原。本研究将一种密码子优化的Asia1型口蹄疫病毒抗原基因及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LTB）基因组合，人工合成了一条全长为1095bp的LTB-Asia1/VP1优化基因，命名为opti-LTB-Asia1/VP1，利用该基因构建了表达Asia1型口蹄疫病毒抗原及黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1，通过农杆菌介导方法转化番茄，获得融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒VP1基因的转基因番茄，这是国内首次将密码子优化的融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒VP1基因转到番茄中，具有极其重要的意义。 

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案： 

一种核苷酸序列opti-LTB-Asia1/VP1，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。