[发明专利]上皮细胞粘附分子的核酸适体EpCAM D及其制备方法

权利要求书

1.上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体命名为EpCAM D，其序列如下：

agcgtcgaat accactacag ctccggggtt tttgggggtt tttctggggt tttttggggc      60

taatggagct cgtggtcag                                                   79。

2.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及基于上述结构做切短、延长、部分碱基替换的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有G四聚体结构或者茎环结构。

3.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成单链DNA随机寡核苷酸库；以Ni微珠为基质，筛选除去DNA随机寡核苷酸库中的非特异性结合部分，以上皮细胞粘附分子EpCAM微珠筛选得到与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸序列；

2）将步骤1）所得与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物以链酶亲和素微珠为基质进行分离，通过碱变性解链，过滤，纯化，即得用于次轮筛选的单链DNA文库，形成次一级核酸文库；

3）将步骤2）所得的单链DNA文库进行下一轮筛选，经过12轮筛选后获得目的寡核苷酸序列；克隆测序所述目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶蛋白结合的特异性和亲和力。

4.如权利要求3所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列，即为5′-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-40nt-CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3′，库容量为10¹⁵以上。

5.如权利要求3所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述PCR扩增的引物为：

引物1：5′-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3′；

引物2：5′-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3′；

所述PCR扩增产物为3’端带有生物素标记、5’端带有FAM标记的双链DNA文库。

6.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体作为与表达EpCAM蛋白的细胞系的核酸适配体。