[发明专利]司帕沙星的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法

权利要求书

1.一种检测司帕沙星的酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征在于：盒体内设有司帕沙星特异性抗体、司帕沙星与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被司帕沙星抗原或特异性抗体的酶标板、司帕沙星标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；所述司帕沙星特异性抗体为司帕沙星的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔铜蓝蛋白；                                                所述酶标二抗为辣根过氧化物酶或羊抗鼠IgG抗体。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述的洗涤液为含

有0.05%-0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的盐酸。

4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述的底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。

5.根据权利要求1-4任一项所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括浓缩样品稀释液，浓缩样品稀释液为含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液；

用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

6.根据权利要求1-4任一项所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述司帕沙星与载体蛋白的偶联物是由以下方法得到的：

（1）称取3mg的司帕沙星、3mg的N-羟基琥珀酰亚胺和3mg的N,N-二环己基碳二亚胺溶于1mL DMF溶剂中，室温下反应3小时，得到A液；

（2）称取5.1 mg的牛血清白蛋白溶于2mL、0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液中，得到B液；

（3）在室温磁力搅拌下，将A液逐滴加入B液中，4℃反应过夜；

（4）反应液用PBS透析3天，换液3次/天；透析完成后，4000r/min离心5min，取上清液，得到司帕沙星与载体蛋白的偶联物，贮藏于-20℃，备用。

7.根据权利要求1-4任一项所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述司帕沙星的单克隆抗体是由以下方法制备的：

（1）免疫 以SPFX-BSA为免疫原，取SPF级6-7周龄BALB/c雌性小鼠进行免疫，每只200μL，初次每只免疫剂量为30μg，其后3次的免疫剂量均为50μg/只；采用背部皮下4-6点注射，初免用SPFX-BSA的 PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫；20d后用SPFX-BSA的PBS溶液与等体积FIA混合乳化后加强免疫，免疫间隔3周，第五次免疫后进行细胞融合；

（2）细胞融合  将NS0骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例在PEG的作用下融合，然后置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半量换液，8天后检测细胞上清，筛选阳性孔；

（3）杂交瘤细胞的筛选  细胞融合后，取各孔细胞上清，用PBS稀释5倍后用间接ELISA测定效价，用小鼠血清作阳性对照，挑选阳性孔，使用间接竞争ELISA法测定敏感性，选取效价高于或等于对照孔的细胞孔，转入24孔细胞板中进行扩大培养，待细胞长至底部一半以上时，再次测定效价和敏感性，进行敏感性测定，选取敏感性最高的孔进行亚克隆；

（4）单克隆抗体的制备  将BALB/C小腹腔内接种液体石蜡，每只小鼠接种量300～500μL，将筛选出的单克隆细胞株转入细胞培养瓶中进行扩大培养，待细胞保持对数增长的时候用无血清培养基稀释，将0.5×10⁷～1.0×10⁷个克隆化的阳性细胞注入小鼠体内，观察小鼠腹水生产情况，当小鼠腹部出现明显肿大且腹部皮肤紧绷时即可采集腹水，然后3000r/min离心5min，吸取上清除去细胞及杂质，得到司帕沙星的单克隆抗体。