[发明专利]一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及以血红蛋白（hemoglobin,Hb）为原料制备生物制品时病毒灭活的方法。

背景技术

用人或者动物的血红蛋白制备生物制品，为防止病毒的交叉感染，其生产工艺须具备一定的去除/灭活部分病毒能力，将其可能含有的病毒部分或全部去除。

由于不同生物制品潜在的病毒种类不同，所选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同，故而有多种去除/灭活的方法。根据生物我国生物制品《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，常用的方法有：⑴巴斯德消毒法（巴氏消毒法）；⑵干热法（冻干制品）；⑶有机溶剂/去污剂（S/D）处理法；⑷膜过滤法；⑸低pH孵放法；⑹化学灭活方法。其中低pH孵放法作为一种病毒灭活方法，常见用于生产人免疫球蛋白。

无基质血红蛋白（stroma-free hemoglobin,SFH）具有携氧释氧的能力，一直以来被作为氧载体制剂进行研究代替红细胞的功能，具有潜在的临床应用价值，由人或动物血红蛋白开发出来的代替红细胞携氧释氧功能的制剂被称为血红蛋白氧载体（Hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs）。这种制剂主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量或是分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。目前开发的产品主要有四类：（1）聚合血红蛋白；（2）共轭血红蛋白；（3）分子内交联血红蛋白；（4）重组人血红蛋白。

在哺乳动物中，血红蛋白在天然状态下，它由两对亚基组成（2αβ），是一个四聚体的蛋白结构，分子量约为64,000道尔顿，每个亚基上有一个铁卟啉，当铁元素处于II价时，血红蛋白具有携氧释氧的能力，称为亚铁血红蛋白；当铁元素处于III价时，铁元素被氧化，血红蛋白不具有携氧释氧的能力，称为高铁血红蛋白。血红蛋白氧载体必须使血红蛋白处于亚铁血红蛋白时才具有携氧释氧的功能。

亚铁血红蛋白非常容易被氧化成高铁血红蛋白，特别是在低pH条件下，可被迅速氧化，因此，血红蛋白及由其为原料的血红蛋白氧载体都不能直接用低pH孵放法进行病毒灭活。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源或动物源的血红蛋白及血红蛋白氧载体的病毒灭活方法，并避免引起亚铁血红蛋白的氧化。

本发明的基本方案是：

一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法，待处理的血红蛋白或血红蛋白氧载体为溶液形态；该方法是先采用一氧化碳（CO）将溶液中的亚铁血红蛋白转化成碳氧血红蛋白（COHb），然后降低溶液至pH4.0±0.2，在此条件下维持足够时间充分将病毒灭活；再将pH调至7.0—9.0之间，应用透析或者超滤方法将溶液置换为生理溶液，最后用惰性气体将结合在血红蛋白上的CO除去，即完成了病毒灭活的过程。

基于上述基本方案，本发明确立了以下具体操作步骤：

步骤1：在密闭容器中加入血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液并进行搅拌，在溶液上方一侧通入CO气体，从另一侧排出，使亚铁血红蛋白转化成COHb，待转化率大于98%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：逐滴加入酸，使溶液pH逐渐降低至4.0±0.2，保持容器内部与外部大气的阻隔（可以继续通入CO，也可以停止通入CO但密封容器进气口、出气口）；

步骤3：低于20℃条件下，搅拌21天；

步骤4：逐滴加入碱，使溶液pH升至7.0以上（此时允许溶液接触大气）；

步骤5：应用透析或者超滤的方法将蛋白溶液系统置换为生理溶液系统；

步骤6：采用气体交换膜，液相一侧为所述生理溶液系统，气相一侧为惰性气体，将COHb中的CO解离出来（即：将结合于血红蛋白上的CO解离下来），待COHb含量下降至目标范围时，停止通入惰性气体，收集得到的溶液即为灭活病毒后的血红蛋白或者血红蛋白氧载体溶液。

本发明具有以下优点：

①实现了在低pH条件下对血红蛋白或血红蛋白氧载体进行病毒灭活；②不会引起亚铁血红蛋白的氧化，可使血红蛋白维持最初的生理活性状态；③对血红蛋白及血红蛋白氧载体都适用，特别是血红蛋白氧载体，血红蛋白氧载体可以被制备成氧亲和力较低的形式（即氧亲和力接近或低于天然红细胞），其对CO的结合力也相对较弱，因此去除更容易。

具体实施方式