[发明专利]快速检测恶喹酸的试纸条及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫学检测领域，特别是涉及一种检测恶喹酸残留的免疫胶体金试纸条及制备方法。 

背景技术

恶喹酸（Oxolinic Acid，简称OA），别名奥索利酸，分子式为C₁₃H₁₁NO₅，分子量为261.23，属广谱类抗菌药物，特别是对革兰氏阴性菌有很强的抗菌活性，用量少，抗菌效果好，是治疗水生动物疾病的理想农药物之一。恶喹酸通常为白色或类白色的结晶性粉末，无臭无味，不溶于水和乙醇，能溶于甲酸和氢氧化钠溶液，不吸潮，对光、热稳定。但其对人体有一定毒副作用，常见的主要包括胃肠道反应、肝肾毒性以及肌肉骨骼副作用等，美国和日本禁用恶喹酸；欧盟和我国对其在牛、猪、鸡和鱼等肉类中的最高限量规定为50-300 μg/kg。尽管我国兽药残留限量参照国际和发达国家标准制定，并且兽药使用都有休药期规定，但从根本上解决动物性食品兽药残留超标问题仍存在较大难度。因此急需研究建立快速、灵敏、有效的恶喹酸残留的检测方法。 

目前国内外检测恶喹酸残留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/质谱联用分析法（LC/MS）、气相色谱/质谱联用分析法（GC/MS）等，这些方法检测均存在一定缺陷：（1）待检测样品预处理过程复杂，繁琐费时；（2）需要昂贵的仪器设备，推广使用受到一定限制；（3）对专业人员的素质要求高，须有一定相关经验才能获得可靠结果；（4）仪器保养要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；（5）检测费用高；（6）无法进行现场检测和大规模批量检测，且时效性较差。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度较高，精确性好，分析过程相对简单，用作恶喹酸的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，急待研究解决。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便、精准快速的用于检测恶喹酸残留的试纸条及制备方法。 

本发明的技术方案： 

一种快速检测恶喹酸的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。

所述偶联恶喹酸的载体蛋白是通过以下方法得到的： 

称取恶喹酸12mg溶入1mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温条件下加10μL三丁胺混匀，再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌反应3h，然后加入含20mg 载体蛋白的PBS溶液，搅拌反应过夜；反应液用PBS透析3天，4000r/min离心5min，弃沉淀，得到恶喹酸的载体蛋白偶联物，分装并保存于-20℃，备用。

所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。 

所述吸附纤维层用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附恶喹酸的金标抗体玻璃纤维棉制成。 

所述 偶联恶喹酸的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。 

所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹、“十十”字型排列印迹、“┬ ┬”字型排列印迹、“┴ ┴”字型排列印迹、“├├”字型排列印迹或“┤┤”字型排列印迹。 

在所述吸附纤维层、金标抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.6cm处印制有样品标记线。 

所述恶喹酸的试纸条的制备方法，包括以下步骤： 

（1）偶联恶喹酸载体蛋白的制备

将恶喹酸12mg溶入1mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温条件下加10μL三丁胺混匀，再加10μL氯甲酸异丁酯磁力搅拌反应3h，然后加入含20mg 载体蛋白的PBS溶液，搅拌反应过夜；用PBS透析3天，4000r/min离心5min，弃沉淀，得到恶喹酸的载体蛋白偶联物；

（2）抗恶喹酸单克隆抗体或多克隆抗体的制备；

（3）恶喹酸金标抗体的制备；

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备；