[发明专利]一种生产重组狒狒尿酸氧化酶的技术

说明书

技术领域

本发明基因工程酶技术领域，具体涉及狒狒尿酸氧化酶基因的克隆表达方法，本发明还涉及该酶的分离纯化方法。 

背景技术

尿酸氧化酶是生物体内嘌呤代谢途径中的一个酶，以氧作为受体,能够催化尿酸氧化生成尿囊素和过氧化氢(Richette等Lancet2010,318-328)。尿酸氧化酶在生物界广泛存在。从古细菌、细菌、真菌、酵母、放线菌、植物、鱼类、两栖动物和大多数非灵长目哺乳动物及少数灵长目动物体内均能找到尿酸氧化酶。但是在人类和高等灵长目动物，由于尿酸氧化酶基因在进化过程中发生无义突变，致使这些物种，如猿类体内没有尿酸氧化酶存在(Wu等,PNAS1989,9412-9416)。由于缺少尿酸氧化酶，嘌呤代谢产生的尿酸不能被进一步氧化而最终以尿酸的形式通过肾脏排出体外，导致人体内尿酸的浓度明显比其他动物高。高浓度的尿酸存会给人体带来许多严重的疾病，如高尿酸血症，痛风，肿瘤溶解综合症等。 

尿酸氧化酶被发现和应用于医疗始于1974年(Fam等,Current rheumatology reports2005,29-35)。当时使用的是从黄曲霉中提取得到的尿酸氧化酶。之后各种来源的尿酸氧化酶陆续被发现并被用于研究。但是由于纯度不高，难于控制，在使用中产生各种各样的副作用。八十年代，随着基因工程技术的兴起，重组表达尿酸氧化酶逐渐成为获取尿酸氧化酶的主要途径。现今已有多个物种的重组尿酸氧化酶表达成功。Suzuki等(Suzuki等,Plant Physiology1990,384-389)于1990年成功地将大豆尿酸氧化酶基因克隆到大肠杆菌表达。1996年，Candida utilis尿酸氧化酶在大肠杆菌中成功表达(Koyama等,J.Biochem.1996,969-973)。Legoux等(Legoux等,JBC1992,8565-8570)通过将黄曲霉尿酸氧化酶基因克隆到大肠杆菌中,发现尿酸氧化酶在细胞内以可溶性表达形式存在。Ishikawa等(Hongoh等，Insect Biochemistry and Molecular Biology2000,173-182)成功地将Nilaparvata lugens尿酸氧化酶基因克隆在大肠杆菌中表达，但是表达量并未提供。 

重组尿酸氧化酶在临床上的应用则始于1995年，Rozenberg等首次利用 重组尿酸氧化酶用于心脏移植病人的痛风石治疗(Rozenberg等,Rev.Rhum.Engl.Ed.,1995,62(5),392-394),证明了重组尿酸氧化酶在医疗上的巨大前景。2001年，由Sanofi-Synthélabo公司研发的重组黄曲霉尿酸氧化酶注射剂在欧洲成功上市，并于2003年获准在美国上市，用于高尿酸血症的预防和治疗（肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防）。 

发明内容

本发明通过重叠延伸法获得了狒狒尿酸氧化酶基因的全序列，从而解决了天然来源的狒狒尿酸氧化酶不易获得的问题。 

尿酸是一种弱酸，pKa值为5.75。在生理pH7.4条件下，98%的尿酸以尿酸盐的形式存在^[14]。尿酸盐在血液中的溶解度仅为380μmol/L。当人体内尿酸盐浓度超过此值时，尿酸盐将以晶体的形式析出，并随着血液循环而逐渐沉积在人体的关节处，由此而引发一系列相关的疾病，如高尿酸血症、痛风等。 

高尿酸血症是指血液中尿酸含量大于420μmol/L(7.0mg/dL)，高尿酸与糖尿病、高血压、肥胖或高胆固醇血症等几乎所有的成人病都有密切的关系，也可能导致肾障碍、动脉硬化、脑中风、心脏病等严重的疾病，因此是非常重大的代谢异常症状。 

痛风是一种古老的疾病。早在公元前2640年就有古埃及文献对于痛风的记载。确切的临床记载则见于公元前400年Hippocratc的医学著作中。其病因便是由于尿酸沉积在关节处形成所谓的痛风石而引发的一种急性关节炎。古代关于痛风患者的记载主要见于帝王显贵，因而痛风又有帝王病之称。同时由于其发病时给病人带来巨大的痛苦又被称为疾病之王。现今，痛风的发病率呈逐年上升的趋势，尤其以西方发达国家严重。据有关组织统计，英国痛风的发病率1970年为0.3%，1990年为1%，到2005年，这一比例上升到了1.4%。美国痛风的发病率更高，1990年这一比例为2.1%，到1999年已上升到4.1%。随着经济快速发展，人们生活水平和饮食习惯的改变，我国痛风的发病率也呈上升趋势，且发病年龄呈现低龄化。目前我国痛风发病率为0.3%，现有400多万痛风患者，每年有200多万急性发作，近100万人因痛风致残。因此痛风已成为严重影响人们身体健康的疾病之一。