[发明专利]抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种对牛支原体有特异性的单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。属于疾病诊断和检测领域。

背景技术

支原体（Mycoplasma），又称霉形体，是目前已知的能在人工培养基中生长的最小原核微生物。支原体无细胞壁，细胞形态多形化；能够通过0.22μm的细菌滤器(Nicholas&Ayling,2003)。其基因组小，GC含量仅为27.8mol%-32.9mol%，生物合成及代谢能力低下。对青霉素等作用于细菌胞壁的抗生素有抵抗力。支原体在自然界中广泛存在，主要分布于污水、土壤、动植物和人体内。支原体最早于1700年在患有传染性胸膜肺炎的牛中发现，直到1898年法国科学家RouX和Nocard用含有动物血清的人工培养基首次分离成功，并将其命名为胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia Organism，PPO)。此后，不断有新的类似的微生物被分离出来，统称为类胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonsa like organism，PPLO)。1967年，国际细菌命名委员会正式将这类微生物命名为支原体，并一直沿用至今。早期的支原体研究受限于培养条件，研究进展一直很缓慢。直至1962年，Hayflick采用无细胞的支原体培养基成功分离到肺炎支原体后，支原体的研究才逐渐取得极大进展。迄今为止，人们已经分离到190多种支原体，许多能够引起动植物多种疾病。

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）在分类上属于支原体属，同其他支原体一样，牛支原体具有体型微小，基因组成分微量等特征(Caswell&Archambault,2007)。普通光学显微镜不能观察到牛支原体，只有在电镜下才能观察到其外表特征。与大部分支原体一样，牛支原体是一种宿主特异性粘膜常在菌，在牛的呼吸道黏膜、肠道黏膜，泌尿生殖到黏膜，乳腺黏膜、眼结膜均可存在，其主要生存方式是作为寄生或作为条件致病菌的共生关系(Gevaert,2006;Pfutzner&Sachse,1996)。健康牛上呼吸道黏膜的牛支原体，在应激条件下，如长途运输、天机骤变，管理不良等原因，可以转移到其他部位，引起多种疾病(Maunsell&Donovan,2009)。

自Nocard在1898年从患肺炎的病牛胸前积液这两个分离到丝状支原体丝状亚种（MmmSC）以来，人们一直认为MmmSC引起的牛传染性胸膜肺炎(CBPP)是危害养牛业最重要的传染病。然而，1961年康奈尔大学的hela发现的牛支原体逐渐引起全世界的重视。

牛支原体能够引起肺炎，中耳炎，乳房炎、角膜结膜炎等与M.bovis相关的疾病被简称为MbAD。MbAD在欧洲和北美广泛流行，造成了非常严重的经济损失。在英国每年超过190万头牛感染呼吸道疾病，约有157000头小牛死于肺炎和相关疾病，至少有1/4-1/3是由牛支原体引起的。在美国，由于牛支原体导致乳房炎引起的损失比呼吸道引起的损失更加严重，每年约为1.08亿美元。MbAD病原牛支原体于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到，1976确认为牛支原体感染。牛支原体在分类上地位上属于支原体科支原体目支原体属成员，目前由于缺乏牛支原体基因组的完整数据，所有研究工作仍然以全菌体蛋白组分与免疫血清的免疫结果为基础进行。

2008年中国湖北省首先出现牛支原体的病例报告，此后，宁夏，贵州等十多个省市自治区相继出现由牛支原体引起的死亡病例。据我们的统计，MbAD的死亡率可以达到38％，而且临床症状与已经在中国消灭的牛传染性胸膜肺炎（OIE规定必须报告的传染病CBPP）相似，所以最初是被当做CBPP卷土重来而引起了兽医界的广泛关注和焦虑。牛支原体病的快速诊断因而被提上日程。

2012年，任泽民、姜勇等以牛支原体湖北分离株HB0801作为抗原免疫8周龄BALB/C小鼠，利用杂交瘤技术筛选出了6株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞株，分别生产腹水并对单抗进行了纯化和特性鉴定。但是ELISA特异性分析结果表明，这6株单抗不仅与临床分离的牛支原体菌株以及ATCC标准株PG45显阳性反应，同时所有制备的单抗都与无乳支原体PG2有交叉反应，因此无法实现对牛支原体的特异性检测（任泽民、姜勇等，牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定，中国畜牧兽医，2012年第39卷第7期）。

因此，建立一种快速、高通量的针对牛支原体感染的血清抗体检测方法就显得十分重要了。

发明内容