[发明专利]人附睾上皮分泌蛋白4定量测定试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人附睾上皮分泌蛋白4定量测定试剂盒及其检测方法，用于体外定量测定人血清中的人附睾上皮分泌蛋白4含量。 

背景技术

卵巢癌近年来发病率越来越高，在妇科肿瘤中发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌位居第三位，但其致死率却占据首位。这主要是因为卵巢深藏在骨腔内，卵巢癌早期症状十分不明显，缺乏有效的早期诊断，75%的患者在就诊时已属晚期。 

人附睾上皮分泌蛋白4（Human epididymis protein4，HE4）是近年来开发出的一种新型肿瘤标志物，HE4编码基因最早是由Kichhoff等人于1991年从附睾上皮远端分离出来，1999年Schummer等人通过cDNA微阵列分析，发现HE4（又名WFDC2）mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中不表达。之后证实HE4具有卵巢癌诊断的价值，而且在早期卵巢癌诊断中灵敏度和特异性都优于CA125。为了提高卵巢癌早期诊断水平和改善治疗效果，从检测角度上来说，目前临床上用于测定HE4的方法主要有放射性免疫技术、酶联免疫技术和化学发光技术等。 

过去以放射性免疫技术为代表的人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）测定试剂盒由于方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场；目前应用较多的为酶联免疫技术和化学发光技术，其中化学发光技术兴起于上个世纪 80年代，是继酶联免疫技术和放射性免疫技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。 

目前已公示的人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）相关专利共11项，其中包括化学发光技术、酶联免疫技术、时间分辨荧光检测相关技术，而未见磁微粒分离技术与化学发光技术相结合应用到免疫分析中。磁微粒化学发光免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与化学发光免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性强、操作简单的人附睾上皮分泌蛋白4定量测定试剂盒及其检测方法。 

本发明的目的是这样实现的： 

一种人附睾上皮分泌蛋白4定量测定试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有微孔板和位于盒体底部的支撑板，其中微孔板由48或96个微孔组成，支撑板上开有多个孔，所述孔内共放置有八个试剂瓶，所述八个试剂瓶内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有人附睾上皮分泌蛋白4单克隆抗体包被的磁颗粒。

本发明人附睾上皮分泌蛋白4定量测定检测方法，所述检测方法包括试剂准备过程和检测步骤，所述试剂准备过程如下： 

步骤一、磁分离试剂的制备

一、磁珠缓冲液配制

（1）、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，然后称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；

（2）、用移液器将 Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述 1L容器中加入 800ml纯化水，充分搅拌；

（3）、调节pH计测量其 pH值，控制 pH在7.95-8.05之间；

（4）、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

（5）、最后1L容器定容至 1000ml，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；

二、磁分离试剂的制备

（1）、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ulDMSO中，取2mg抗HE4单克隆抗体溶于pH 9.5的0.1mol/L的PB缓冲液中至总体积为1ml；

（2）、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述HE4单克隆抗体溶液中，置室温90min；

（3）、然后将抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；

（4）、取0.5ml磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

（5）、每次加入1.5ml pH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；