[发明专利]抗人血小板胶原蛋白受体的人源性单克隆抗体片段及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，也涉及生物制药技术。具体涉及一种抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”（Glycoprotein VI或GPVI）的人源性单克隆抗体片段及其在医药中的应用。

背景技术

血小板在血管受损处的粘附和激活聚集，最终会导致血栓形成和出血停止，能够避免失血过度。这是正常人的生理保护机制之一。但是，在血管有病变的情况下，由血小板激活导致形成的血栓会阻塞血管，造成下游组织的缺血甚至坏死，发生心肌梗死或脑卒等。因此，抗血栓治疗在医学上有非常广泛的应用。例如用于由血管内皮损伤造成的血栓形成的预防，如冠脉扩张术中用药、心脏瓣膜置换术前和术中的用药，或者指导心肌梗死或脑栓塞引起的卒中后的溶栓疗法用药等。

通常，血小板的激活聚集过程分为两个阶段。早期是它与一些激活因子特异结合的阶段，晚期时血小板内会产生一系列的连锁反应，从而导致共同通路的激活并形成不可逆血栓。目前，医学临床上使用的针对抗血小板激活因子的药物有很多，但其存在的问题也很多。例如阿斯匹林虽能够抑制血栓环素TXA₂的形成，但效果太慢；Clopidogrel用于抑制血小板上的ADP受体，效果不能尽如人意；抗TXA₂受体药会引起低血压的副作用；抗凝血酶肽不仅能够抗血栓形成，同时也抗血凝，这使其无法在医学临床中得到应用。有一种针对血小板激活晚期共同信号传递通路的阻断药物REOPRO（一种抗血小板GPIIbIIIa单克隆嵌合抗体），它阻断血栓形成的效果较好，但它不能区分正常生理止血和病理情况下的血栓形成，因此在临床使用中很容易造成意想不到的内出血。尽管如此，在许多临床治疗中还不得不用它，尤其是进行冠脉扩张术时，因为现有技术中还没有更好的药物替代。

胶原蛋白与其在血小板表面的受体－胶原蛋白受体结合，是激活血小板最强的底物。胶原蛋白受体其中之一“糖蛋白－6”只表达在血小板表面。当血管内皮受到损伤后，就会暴露出内皮下的胶原蛋白。血管内皮损伤和剥脱导致血管基底膜暴露的常见原因包括冠状动脉、颈动脉和颅动脉粥样硬化斑块的溃破等。被暴露的胶原蛋白能通过与其受体结合激活血小板并导致血栓生成（clotting），形成阻断血流的局面，最终造成心肌缺血（心绞痛和心肌梗死）和脑血液循环障碍（脑卒中）等严重疾病。在抗TXA₂受体、抗ADP受体和抗凝血酶受体等药不能满足临床使用需求下，对抗血小板胶原蛋白受体抗体研究成为当今抗血小板药物的研究热点。

胶原蛋白具有分子大、凝聚后结构复杂的特征，小分子化学药物不能阻断它与其受体的结合和由此导致的血小板的激活和血栓形成。而单克隆抗体，由于与靶点亲和力强和特异性高、且由于分子量大而可起到有效的阻断作用，再加上人源化后不太容易引起中和性抗体的产生和造成副作用，因此被公认为是阻断胶原蛋白受体“糖蛋白－6”最佳的选择和被首先开发的对象。人们首先是对血小板胶原蛋白受体“糖蛋白－6”进行分子克隆，以此可以用来作为免疫靶点和下一步的单克隆抗体的筛选。经过多年的努力，现今，几家试验室已经研究得到了多个有阻断效应的单克隆抗体(Matsumoto et al.Thrombosis Res.119:319-329,2007。Masberg et al.JEM197:41-49,2002。Lecut et al.J Throm Haemosta1:2653-2662,2003。Moroi et al Throm Haemosta89:996-1004,2003。Chen et al JBC277:3011-3019,2002)。这些单克隆抗体不仅在多肽氨基酸的序列和亲和力不同，在胶原蛋白受体“糖蛋白－6”上结合（抗原上的识别）的位点也不一样。有两家试验室还获得了胶原蛋白受体“糖蛋白－6”基因敲除的小鼠（Kato etal.Blood102:1701-1707,2003。Lockyer et al.Thrombosis Res.,118:371-380，2006）。无论是用单克隆抗体还是基因敲除的小鼠，体外（包括人和动物）和动物（包括猴子）体内的试验，都证实了胶原蛋白受体“糖蛋白－6”是很好抗血栓药物的靶点：既有效但又不引起出血时间延长（不同于REOPRO）；而且还证实单克隆抗体是有效的胶原蛋白受体“糖蛋白－6”的阻断剂。因此，通过阻断胶原蛋白受体“糖蛋白－6”而具有抗胶原蛋白来激活血小板的单克隆抗体有望成为具有广泛临床应用价值的抗血栓药。