[发明专利]一组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及海水鱼类感染病毒检测技术领域，特别涉及一种虹彩病毒的快速检测方法。

背景技术

虹彩病毒（Iridovirus）是近年来新发现的一种最严重的鱼类传染性病毒之一，可在野生和养殖的鱼类中引起较高的发病率和死亡率，能引起鲈脾肿大症、石首鱼暴发性传染病、真鲷虹彩病毒病、牙鲆淋巴囊肿病、石斑鱼慵懒病、甲鱼“红脖子病”等近百种水生动物疾病，症状主要表现在脾脏肿大及其细胞坏死等现象，死亡率高达30%（成年鱼）-100%（鱼苗），危害性极大。近年来，这种病毒在东亚和东南亚地区引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势，在海水养殖鱼类中有很多报道，致使鱼类大面积的死亡，造成了严重的经济损失，因而被称为“海洋口蹄疫”。

组织培养法一直是虹彩病毒检测的“金标准”方法，虽然其特异性较强，但检测步骤复杂，耗时较长，且灵敏度偏低。

近年来，针对虹彩病毒的检测，先后建立了间接荧光抗体检测方法、酶联免疫吸附（ELISA）检测方法等。然而这些免疫学检测方法也存在缺点，比如检测时间较长，往往需要5-6小时才能出结果，而且需要制备单克隆抗体，技术成本较高。

随着分子生物学的飞速发展，对虹彩病毒的检测手段也有了快速的发展。例如采用聚合酶链式反应（PCR）和实时聚合酶链式反应（real-time PCR）检测虹彩病毒。这些方法快速简单，灵敏度高，反应时间较以前的方法短，但仍需要较长时间，而且需要使用PCR仪等贵重仪器，对使用范围有限制。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一组用于检测虹彩病毒的引物及其检测方法。

一组用于检测虹彩病毒的引物，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。

作为本发明一组用于检测虹彩病毒的引物，为SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸，或者SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸的互补链。

本发明还提供一种检测虹彩病毒的方法，采用的引物可以与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。

作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，本发明检测虹彩病毒的方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）准备检测样本；

（2）提取样本的总DNA；

（3）对步骤（2）的DNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60～65℃，反应时间为10～60分钟；

（4）终止反应；

（5）检测所述扩增引物。

作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，所述的方法的步骤（5）所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。

作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，所述的检测样本选自下列样本:

(1)海水鱼类的感染组织；或者

(2)海水鱼类的细胞培养物。

本发明用于检测虹彩病毒的引物灵敏度高、特异性强；本发明虹彩病毒的检测方法，采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。

附图说明

图1是环介导等温扩增反应产物的特征性梯状条带和酶切鉴定电泳图：泳道M：marker；泳道1：扩增产物用限制性内切酶MstⅠ酶切产物，得到217bp，252bp大小的两条主带，说明是特异性扩增；泳道2：扩增原始产物，表现出特征性的梯状条带，不能通过片段的大小来鉴别是否为非特异性扩增；

图2是等温孵育不同时间的产物含量的电泳图：在20分钟时就出现了特征性扩增条带，表明20分钟即可完成反应；泳道M:marker；泳道N：阴性对照；其他泳道为不同时间的产物，数字代表时间，单位：分钟；

图3是灵敏度实验结果的电泳图：泳道M：marker；泳道N：阴性对照；泳道0到－6表示病毒DNA模板按5倍稀释后（标号取5的对数log5，－1即稀释5倍）的扩增产物；图上半部分是利用F3和B3做PCR的电泳结果，产物约210bp；图下半部分是本发明方法的结果，可得该方法比PCR灵敏25倍左右；