[发明专利]利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备9α-羟基-雄烯二酮的方法，特别是涉及一种利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法。

背景技术

9α-羟基-雄烯二酮（9α-OH-AD）是一种抗动情甾体工业化生产中的关键中间产物，在甾体工业化生产中起着重要作用。利用9α-羟基-雄烯二酮作为前体物可以合成氢化可的松、17α-OH黄体酮、依普利酮、β米松、地塞米松、可的松、氟美松、氟孕酮、氟氢松、特美肤、曲安西龙等多做种重要的甾体原料药，具有重要的商业价值。制备9α-羟基-雄烯二酮的关键是在雄烯二酮第9位健上加一个羟基。目前，国内外大多采用化学合成法，但是化学合成法不仅合成步骤多、收率低，而且生产过程中需要用到多种有毒化学试剂，环境污染非常严重。

3-甾酮-9α羟基化酶是甾体微生物代谢的一个关键酶，该酶在微生物中广泛存在，例如：红球菌属Rhodococcus、诺卡氏菌属Nocardia、节杆菌属Arthrobacte、分枝杆菌属Mycobacterium。3-甾酮-9α羟基化酶负责在甾体的多元环的第九位上引入一个9α羟基。因此，利用具有9α羟基化酶活性的微生物转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮已成为近年来人们研究的热点。Mutafov及同事研究了具有9α羟基化酶活性的红球菌(Rhodococcus sp.)菌株转化雄烯二酮生成9α-羟基-雄烯二酮的能力，发现其转化率仅为25%左右【Process Biochemistry32(7),585-589(1997)】；Kieslich等研究了利用Corynespora cassicola菌转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮的方法，虽然其转化率提高到80%左右，但是其底物投料浓度不到1%（参考美国专利4237220A）；Marsheck等对Nocardia canicruria转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮也进行了报道，其转化效率可达90%左右，但是其投料浓度也非常低，不到1%（参考美国专利4397947A）。

综上所述，利用微生物法转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮所面临的主要问题是底物投料浓度低、生物转化效率低、产物总收率小、生产成本高等一系列问题。因此，开发一种简单高效、经济实用的9α-羟基-雄烯二酮的制备方法是当务之急。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法。通过该方法，能克服现有技术中的投料浓度低、转化时间长、生产成本高等缺点。

为解决上述技术问题，本发明的利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法，包括步骤：

1）一级种子培养

将红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）作为生产菌种，并接种于含碳源和氮源的种子培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得适于接种的种子；

2）二级发酵培养

将步骤1）所得种子接种于转化培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得发酵液；

3）底物雄烯二酮转化

在步骤2）所得的发酵液中投入雄烯二酮溶液，继续在150～350rpm转速下，26～35℃培养48～96h，得到转化液，并检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量；

4）分离和提取步骤3）所得的转化液中的9α-羟基-雄烯二酮。

所述步骤1）中，红平红球菌为红平红球菌ATCC14887；含碳源和氮源的种子培养基中，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉或它们的组合，碳源的含量为0.5g/100mL～3g/100mL；氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、蚕蛹粉或它们的组合，氮源的含量为1g/100mL～6g/100mL；种子培养基的pH优选范围为pH7.0～7.2。