[发明专利]一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和药物领域，具体涉及一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物及其应用。

背景技术

肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，并同时保护正常细胞免于细胞毒副反应。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的Ⅰ、Ⅱ期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF-κB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。

Sarah G.Hymowitz等研究发现TRAIL在形成三聚体时生物活性最强，同时受体激活时也成三聚体形式，三聚体顶部附近的锌结合位点对维持TRAIL的结构与稳定性起到重要作用，TRAIL分子中还存在一些特殊位点，第109位的天冬氨酸（Asp）是一个潜在的N糖基化位点，可被金属蛋白酶从膜上切下而产生一相对分子质量为24000左右的可溶性活性肽段（114-281），称为rTRAIL。该片段可形成分子量分别为48000和66000左右的二聚体和三聚体，TRAIL的药物应用多采用此肽段。离体实验表明，全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。与TNF家族其它成员相比，TRAIL最独特的区别在于，其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12-16个氨基酸组成的凸出的环（AA loop）,此结构可插入受体的TRAIL结合位点，从而保证受体与TRAIL特异性结合，研究表明，此插入环与TRAIL细胞毒性作用有关。另外，TRAIL序列中Cys230残基在维持TRAIL的结构和生物活性中具有重要作用。若Cys230突变为Ala或Ser，TRAIL蛋白的稳定性下降，而且不能螯合锌原子形成三聚体，与受体结合能力也会下降200倍，严重影响TRAIL的诱导凋亡的活性。然而，TRAIL的半衰期短（10～30分钟）、不稳定和生物利用度低等缺点制约了其在临床研究上的进一步发展。

聚乙二醇（PEG）是一种pH中性、无毒、水溶性较高的亲水聚合物，其重复单元为氧乙烯基，端基为两个羟基，呈线性或支化链状结构，PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物。由于PEG无毒且具有良好的生物相容性，PEG已被FDA批准可作为体内注射药用聚合物。PEG化是一项用于延长蛋白质半衰期、增加可溶性和稳定性的技术。美国食品与药品监督管理局（FDA）批准上市了许多PEG化蛋白药物，如PEG-asparaginase，deaminase等，证明了该项技术的安全性和有效性。因此，研究者们选择用聚乙二醇对TRAIL进行修饰，以克服其上述的缺点。他们选择用单甲基化聚乙二醇乙醛（mPEG-ALD）对TRAIL进行PEG修饰，因为在低pH（pH=5）的条件下，mPEG-ALD可以与TRAIL的N端特异性反应，然后经硼氢化钠还原后形成稳定的PEG-TRAIL偶联物。但是研究者为了稳定TRAIL的三聚体结构，在TRAIL的N端与PEG之间引入了亮氨酸拉链（LZ），形成PEG-HZ-TRAIL。这种偶联物的不足之处在于：首先，LZ-TRAIL据文献报道具有肝毒性，尽管针对PEG-HZ-TRAIL的研究表明其能改善LZ-TRAIL的肝毒性，但这始终是一个隐患；其次，PEG-HZ-TRAIL只保留了原有TRAIL大约7.3%左右的活性，表明这种PEG修饰方式对TRAIL的活性影响较大；最后，PEG-HZ-TRAIL的偶联需要12h的时间。

因此亟需寻找另一种偶联速率快、最大程度保留TRAIL活性和除去了肝毒性隐患的PEG化TRAIL，来解决上述问题。

发明内容

本发明提供了一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物，利用单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-MAL）对rTRAIL突变体进行定点修饰，不仅最大程度地保留了rTRAIL的抗肿瘤活性，还大大延长了rTRAIL的半衰期，而且不存在肝毒性隐患。