[发明专利]禽传染性支气管炎病毒的致弱方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的致弱方法，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎病毒的致弱方法。

背景技术

禽“肾型”传染性支气管炎，是禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis)的一种病理表现形式，以呼吸道和肾脏病变相结合的一种急性、高度接触性传染性疾病；其特征为病鸡呼吸道症状、产蛋数量和品质下降、肾病变，幼雌鸡感染可引起输卵管永久性退化。

禽传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病广泛分布于世界各养禽国家和地区，如北美洲、南美洲、西欧、非洲、中国、澳大利亚和新西兰等，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。在我国禽传染性支气管炎的感染率可达80-100％，产蛋率可下降50-70％，死亡率可达10-50％，造成的经济损失每年可超过十亿元。该病是继鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊病之后，又一严重危害我国养禽业的烈性传染病。

IBV是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，基因组为单股正链RNA。病毒形态为近球形，直径80-120nm，具有囊膜，囊膜表面有棒状纤突，长约20nm。IBV的主要结构蛋白S蛋白、M蛋白和N蛋白的分子摩尔比为1:6:15。I其病毒粒子的结构由内部的基因组与N蛋白结合成螺旋状、外面包括一层由M蛋白构成囊膜，花瓣状或梨状的S蛋白铆定在囊膜并伸展出来形成突起。目前研究最多的是S蛋白。S蛋白(180KD)位于病毒的最外面，构成病毒的纤突。它在宿主细胞内可被裂解为等摩尔的S1(90KD)、S2(84KD)亚单位。目前研究表明，与M、N蛋白相比，S蛋白进化活跃，变异主要发生在S1上。S蛋白是IBV最重要的保护性抗原，决定IBV的血清型及组织嗜性，其作用表现为刺激机体产生中和抗体，在病毒吸附细胞过程中发挥作用，在血清学分类上起决定性作用。其中，S1蛋白在病毒吸附过程中发挥重要作用，其与宿主细胞膜上糖蛋白受体的结合是IBV吸附细胞的前提条件；S1诱发血凝抑制抗体和多数中和抗体；且S1蛋白的氨基端在决定IBV毒株的组织亲和性及其毒力方面具有一定作用。

目前国内外均有关于IBV连续传代致弱的相关报道，但是基本上均采取接胚后于37℃的环境下进行病毒的繁殖，且传代过程中各代次均使用相同的培养时间或者培养时间不明确。现有技术中的致弱方法致弱速度慢，不但浪费了大量的人力、财力、时间，而且容易使病毒丧失免疫原性，从而无法对我国禽业生产起到及时的保护作用。

发明内容

有鉴于此，有必要针对禽传染性支气管炎病毒在常规温度连续传代培养中致弱速度慢的问题，提供一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法。

一种禽传染性支气管炎病毒的致弱方法，包括以下步骤，毒株YX10接种SPF鸡胚，每胚接种10^3.5-4EID₅₀/0.2mL，培养一定时间后，将鸡胚置于-20℃半小时后，无菌收集尿囊液，进行下一代次传代；第1代-第10代培养温度为37℃，培养时间为48小时；第11代-第14代培养温度每一代降低1℃，培养时间为48小时；从第15代起培养温度为32℃，培养时间为32-48小时。

优选地，所述SPF鸡胚在相应培养温度孵育8-12小时后再进行接胚。

优选地，第15代-第60代培养时间为40-48小时，从第61代起培养时间为32-42小时。

更优选地，第15代-第60代培养时间为44小时，从第61代起培养时间为36小时。

更优选地，第15代-第60代培养时间为48小时，从第61代起培养时间为40小时。

更优选地，第15代-第60代培养时间为40小时，从第61代起培养时间为32小时。

随着代次的增加，病毒的最适培养时间减少，第60代之前的最佳培养时间为44小时，第61代之后的最佳培养时间为36小时。这是因为随着病毒传代次数的增加，病毒对鸡胚逐渐适应，从而可以对鸡胚产生越来越明显的病变，导致鸡胚中尿酸盐沉积。为了能够收集到清亮的尿囊液，需要我们及时地对鸡胚接毒后的孵育时间进行调整。