[发明专利]针对大肠杆菌O157的RNA恒温扩增核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及致病菌的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的大肠杆菌O157(O157)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

大肠杆菌O157，属肠杆菌科，埃希氏菌属，是主要的肠道致病菌之一，肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7被WHO定为新的食源性致病菌，可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症和血小板减少性紫癜等。大肠杆菌O157感染常与生牛肉，鲜牛奶或以鲜奶为原料加工的乳制品有着密切的关系。其他已知的传播途径有生牛奶、香肠、烤肉、未经氯消毒的市政用水、苹果汁、生蔬菜、沙拉和蛋黄酱。此外食品也可能被感染大肠杆菌O157的食品加工人员污染。

目前国内食品中大肠杆菌O157检测方法主要以国家标准GB/T4789.6-2008和行业标准SN/T0973-2010为依据，这些标准多依赖于传统的分离培养、镜检观察、生化鉴定、血清学分型等实验，一般的检测周期在5～7天左右，存在着检验周期长，工作量大等缺点。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展。目前已公开了很多检测E.coli O157的方法，如PCR及荧光PCR方法（行业标准：SN/T1869-2007、SN/T2754.2-2011）。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SimuLtaneous AmpLification and Testing，简称SAT）是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者能够检测活菌，核酸扩增在一个温度下进行（42℃），无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。SAT技术直接以病原微生物特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，而自然界中病原微生物死亡后靶标RNA会快速降解，从而实现食品致病菌活菌检测。

发明内容

为解决现有的大肠杆菌O157(O157)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、能避免假阳性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的大肠杆菌O157(O157)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的大肠杆菌O157(O157）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增），包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的大肠杆菌O157(O157)的靶标核酸（O157RNA）序列特异结合，在有O157内标（O157IC RNA）时，其最好还可与该O157内标序列特异结合,所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述O157检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述O157检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和O157检测探针存在于一O157检测液中。

再进一步所述试剂盒还包含有O157内标和内标检测探针；所述O157内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与O157靶标核苷酸（O157RNA）使用同一对引物（T7和nT7），O157内标由序列表中序列7所示的O157IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，

更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标，其中：

裂解液：含硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）和HEPES；