[发明专利]猪小肠复合抗菌肽的制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医、生物制品、生物制药领域，具体涉及到一种猪小肠复合抗菌肽的制备方法及用途。

背景技术

抗菌肽是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽。有的国际文献中使用“抗微生物肽”（Antimicrobial peptides, AMPs）或“肽抗生素”（peptide antibiotics）。抗菌肽具有抗菌作用，有些还具有抗原虫、抗真菌、抗病毒和抑制或杀伤肿瘤细胞、寄生虫等作用。它具有分子量小（3-10 KD）、水溶性好、耐热、无免疫原性等特点，可成为一种高效、低毒且无残留危害的抗菌、抗病毒和抗癌新药。

目前很多微生物对传统抗生素产生了广泛耐药性，而抗菌肽在经过了几百万年的进化历程仍保留了其强大的抗菌效力，微生物不易对其产生抗药性。由于抗菌肽广谱高效的抗菌活性及其独特的抗菌机制，使抗菌肽格外引人关注。

至2003年，意大利Trieste大学抗菌肽数据库收集有28种猪源抗菌肽或者抗菌肽前体分子，其中来源于猪小肠的抗菌肽或者抗菌肽前体分子有8种：

分子量抗菌肽种类具体分子量3000-8000D5种3339D、3910.5D、4720D、5972D、6150D8000-10000D3种8178D、8925D、9341D10000D以上1种19495D

之后陆续又有新的猪小肠抗菌肽被发现，如5972Da猪小肠抗菌肽被马卫明发现。

由于肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，且抗菌肽常常存在于胞浆颗粒中，其分子量较低，在组织中的含量较低，因而分离和纯化比较困难。以往提取小分子多肽的方法主要有：有机溶剂抽提法、水浸提法和有机酸抽提法等。然后离心得到的粗提物含有蛋白质、盐类和其他小分子。下一步分离纯化，方法包括：过滤层析（介质有Sephadex、Biogel、Sephacryl）、离子交换层析、疏水交换层析、凝胶电泳以及反相高压液相色谱等。如：有人采用隔水煮沸后酸提取，离心得到粗提物，依次经Sephadex G-100凝胶柱、Sephadex G-25或Biogel P10凝胶柱过滤层析，分别将分子大小不等的蛋白质和盐类分开。初步纯化所得猪小肠抗菌肽粗制品，经10kD超滤离心管除热源，再经3-5KD超滤离心管做进一步纯化。这些方法操作复杂，要经过多次的分离纯化才能得到抗菌肽，浪费成本，收率不高，且往往得到的是单一分子量的猪小肠抗菌肽，很难得到复合抗菌肽。

在膜分离技术中，通常有两种类型的过滤：常规垂直过滤（Normal Flow Filtration,NFF）和切向流过滤（Tangential Flow Filtration,TFF）。在常规垂直过滤中，所有的流体直接通过滤膜，被截留的物质堆积膜表面。由于这些物质的堆积，通过滤膜的流量迅速下降直至完全停止，如图1；而在切向流过滤中，流体如图2、图3所示十字地流过滤膜。

切向流过滤与常规垂直过滤不同，液体切向流过膜表面，流体产生的跨膜压力将部分溶液压过滤膜，截留部分则在系统中循环回流。整个过程中液体以一定速度连续流过滤膜表面，过滤的同时也对滤膜表面进行冲刷，使膜表面不形成凝胶层，从而使料液中的颗粒不会很快堵塞滤膜，保持了稳定的过滤速度。