[发明专利]用于检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

李痘病毒(Plum pox virus,PPV)是核果类果树危险性最大的病毒之一，果树一旦受其侵染，则会造成未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，并且使果实品质大幅度下降，而且该病毒传播速度快，在短时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。该病毒1915年在保加利亚首次被发现，而后迅速传遍欧洲大多数国家以及地中海、中非、印度和智利，目前美国和加拿大也有其发生的报道。由于该病毒危害性及其严重，因此它已被欧洲植保组织列入了A2类检疫性病原物，其它国家也对其表现出极高度的重视，纷纷加大对其研究的力度并制定了一系列严格的检测和根除措施，防范于未然。目前中国暂未有发现有关该病毒的正式报道，由于目前我国同其他国家种质资源交流越来越频繁，为了防止该病毒随着苗木等繁殖材料的引进而进入我国，以保护我国农业的健康和可持续发展，必须加强对该病毒的检验检疫！

目前，我国出入境植物病毒检测所采用的主要技术方法是酶联免疫吸附（ELISA）检测和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。传统的ELISA技术在实际应用过程中存在检测灵敏度低，检测耗时长，容易出现假阳性结果；RT-PCR技术虽然灵敏度高，但是存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，难以实现植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。因此，建立新的快速、简捷、灵敏的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。

植物病毒病的诊断和病原鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的基础，也是植物病毒分类学研究的一个重要内容，植物病毒检测的基本内容包括病毒的生物学特性、形态学特征、理化特性、基因组结构、抗原特性等几个方面，涉及到生物学测定、血清学测定、生理生化测定、电镜技术、分子生物学技术等多种手段。目前，我国出入境植物检疫所采用的检测技术的主要手段主要是：口岸现场检疫、生长季隔离检疫、指示植物检验、血清学检验、分子生物学检验。这些手段存在的主要问题为：1：检测周期长，不符合国务院提出的“加快通关速度”的精神；2：容易出现假阳性反应；3：检测方法繁琐复杂，不利于基层单位实际应用；4：主要检测试剂或产品来源于国外公司，不仅购买价格高，而且定购时间长，这些都不能适应我国经济快速发展的需要。因此，建立新的快速有效的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。

目前对病毒的主要技术检测方法是酶联免疫吸附（ELISA）检测和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。ELISA可以定性、定量测定样品中的病毒，是实现目前鉴定病毒的最好手段之一。但是，血清学反应的必须具备高效的抗血清，另外血清学检测对一些病毒含量低和含有干扰测定物质的样品则不能做出准确的测定，容易出现假阳性的结果，并且存在检测时间长的问题，不能满足目前口岸快速检测的要求；RT-PCR技术是应用最广泛的分子生物学新技术之一，利用RT-PCR技术对病毒的检测相比ELISA检测具有灵敏度高的特点，可检测的最低病毒含量达到fg水平。目前在RT-PCR技术基础上不断衍生出许多新的技术，例如实时荧光RT-PCR技术，基因芯片技术等，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高，但是这些分子生物学技术存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，限制了植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。

纳米生物技术是运用纳米技术的理论与方法，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物学研究。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值：（1）高效富集：纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；（2）可操纵性：纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离;（3）标记性质：生物分子标记方法简单、可靠；（4）人体安全：对人体无毒、可生物代谢、可生物降解、生物相容性好。总之，磁性生物分离兼具磁性载体的超顺磁性和亲和配基的生物特异性特点，集磁性分离的快速简便和亲和分离的高选择性双重优势于一体，在核酸的分离纯化，RNA、DNA分子的富集，蛋白的纯化，病毒、细胞的分离等方面有应用。

关于纳米磁珠（magnetic nano particles，MNP）的合成，国外在80年代末开始超顺磁性氧化铁超微颗粒的研究，基于纳米磁珠的生物分离材料国外已经有市场化产品，最近纳米磁珠在动物病毒检测得到应用，抗体标记的纳米磁珠从液相中捕获目标病毒，可以高灵敏度地检测动物病毒。