[发明专利]一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物不对称合成领域，具体涉及一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法。

背景技术

他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A（HMG-CoA）还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物，特别是阿托伐他汀和罗素伐他汀近些年都进入了全球最畅销药前十名。(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN 或OR)是合成此类降胆固醇药物的关键手性中间体，可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学还原方法的反应条件往往需要低温(如-70 ℃)，及易燃的硼烷类化合物参与，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相比较而言，生物法的反应条件温和，更加实用和环保。

目前生物法主要有酶法和全细胞催化两种。例如美国专利US2008/0248539 公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法利用外源添加的葡萄糖脱氢酶和辅酶因子来维持反应的进行，而且在反应中会产生葡萄糖酸，需用碱维持反应的pH，增加了操作程序，影响反应的原子经济性。国内专利CN 102978249公开了一种酮还原酶生产(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法添加的是冻干酶粉，而且添加了价格昂贵的辅酶因子，成本较高，无法进行大规模产业化应用。国内专利CN 102643757公开了利用在土壤中筛选到的季也蒙毕赤酵母菌催化生产(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，但天然菌株全细胞目的酶活低，杂酶种类多，催化存在着效率低，产物纯度不高等不足。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反应步骤简单、成本较低、产品纯度高，可大规模生产(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN 或 OR)的绿色生物制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN 或OR)、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN 或 OR)。

所述的含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为：将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。

进一步地，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，诱导终浓度为0.2～1.0mM，其中优选异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

进一步地，所述的水相缓冲液浓度为20～200mM，为三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH为6.0～8.0；其中更优选三乙醇胺缓冲液， pH6.5～7.5。

所述所述的水相缓冲液为50mM三乙醇胺缓冲液，其配置方法为：称取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去离子水700ml 溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至1000ml。

进一步地，反应起始时的反应体系中，底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN 或 OR)的浓度为10％～30％(w/v)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的10％～30％(w/w)，异丙醇的浓度为3％～12％(w/v)。根据一个优选方面，反应起始时的反应体系中，底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN or OR)的浓度为12％～20％(w/v)，反应中无需添加辅酶因子。