[发明专利]肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法及试剂盒

权利要求书

1.肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法及试剂盒，其特征在于：盒内设有提取外周血基因组DNA的试剂，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂，5×预混PCR反应体系，以及针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针：

GSTM3-上游引物：5’CGTACGGTTTTGTGGAGTC 3’；

GSTM3-下游引物：5’TCCGAACCTTCGAAAACTAA 3’；

GSTM3-探针: 5’Fam AAACCCACGCGCGAACGCC 3’BHQ1；

ALU-C4-上游引物：5’GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’；

ALU-C4-下游引物：5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’；

ALU-C4-探针: 5’Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’BHQ1。

2.根据权利要求1所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于：盒内设有标准品，阳性对照和阴性对照。

3.根据权利要求2所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于：该阳性对照为重亚硫酸盐修饰的100%甲基化的人基因组DNA。

4.根据权利要求2所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于：该阴性对照为高压的双蒸馏水。

5.根据权利要求2所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于：该标准品为包含目的基因片段的质粒。

6.肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其步骤在于：首先，提取待测样本外周血基因组DNA，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰，分别用目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针，对处理过的DNA进行实时定量聚合酶链式（PCR）反应, 其中阴性对照是将体系中DNA模板替换为高压的双蒸馏水，阳性对照是将体系中DNA模板替换为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA， 通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得，实时定量甲基化特异性PCR方法对目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4进行扩增；以标准品的扩增结果制备标准曲线；采用实时定量甲基化特异性PCR的方法，同时对重亚硫酸盐处理后的样品DNA分别检测目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4的阈值循环值，计算出目的基因GSTM3甲基化程度的定量值。

7.根据权利要求6所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其特征在于：采用重亚硫酸盐对基因组DNA进行甲基化修饰，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用作扩增模板。

8.根据权利要求6所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其特征在于：通过荧光PCR仪获得各PCR反应管的甲基化反应的阈值循环值，其GSTM3甲基化的计算公式为：甲基化率=100%×2 exp-[ΔCp(样品GSTM3 Cp值-样品ALU-C4 Cp值)- ΔCp（阳性对照GSTM3 Cp值-阳性对照ALU-C4 Cp值）]。