[发明专利]一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法

权利要求书

1.一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，其特征在于按如下的步骤进行：

染色体标本制备

（1）按常规植物材料培养，待种子或植株根尖长至0.5-1cm；

（2）切下生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯溶液室温下预处理3-5小时；

（3）吸去预处理液，根尖用蒸馏水或0.075mol/L 氯化钾低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定20min-1小时；

（4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液；

（5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时； 

（6）蒸馏水洗去酶液，用0.075mol/L 氯化钾后低渗15-30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min；

（7）取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥；

（8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色10min，自来水冲洗凉干；

（9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在-20℃冰箱中保存待用；

5S rDNA探针制备

从拟南芥5S rDNA序列中选取一段20个碱基左右的高度保守序列，合成时在探针的5’或3’端连接一个荧光基团：

5’- CTGATGGGATCCGGTGCTTT -3’ ，5’端带红色荧光标记TAMRA；

染色体荧光原位杂交：

A：染色体标本预处理 

（1）在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置；

（2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；

B：染色体标本变性

（1） 在标记处加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min；

（2）去掉盖片，-20℃的70%、85%、100%冷乙醇脱水，每级3min，空气干燥；

C：杂交 

（1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL；

（2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片；

（3）于湿盒中37℃杂交1-2小时；

D：杂交后洗脱 

（1）在4×SSC，0.2%Tween 20中室温下避光洗涤10min；

（2）蒸馏水冲洗片刻，避光空气干燥；

E：杂交信号检测 

（1）滴加3μL含有DAPI的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片；

（2）Nikon 80i荧光显微镜观察，按照所记录的标本坐标在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S rDNA杂交信号；

（3）SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成。