[发明专利]一种CK15角蛋白及基因的应用方法

权利要求书

1.一种CK15角蛋白及基因的应用方法，其特征在于所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行细胞癌的早期诊断,手术后期随访等试剂产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种CK15角蛋白及基因的应用方法，其特征在于所述用免疫检测诊断尿路上皮移行细胞癌的产品包括：与CK15蛋白特异性结合的抗体及非抗体类结合体，它的应用方法包括（A）、组织分离，手术切除待检的尿路上皮组织，分离后，迅速提取病灶及周围5cm以外正常组织，将待检样品组织块剪成适当大小印压于玻片上，用4％多聚甲醛固定5～10分钟，晾干；

（B）、将制备好的样品置于2%BSA或10%BSA中，于37℃孵育湿盒内封闭30min； 

（C）、加入商业生产或自行制备的CK15蛋白的特异性抗体，用0.01M pH7.4的PBS稀释进行1:100稀释，于37℃孵育30 min过夜孵育，然后用0.01M浓度的 PBST漂洗5 min×3次； 

（D）、加荧光标记的CK15蛋白的二抗抗体，于37℃湿盒避光孵育30 min，再用0.01M 的PBST避光漂洗5min×3次，用甘油缓冲液封片并镜检，阳性结果为人类尿路上皮移行细胞癌。

3.根据权利要求1所述的一种CK15角蛋白及基因的应用方法，其特征在于所述的诊断尿路上皮移行细胞癌的产品包括：用CK15角蛋白免疫检测RT-PCR、实时定量PCR 诊断尿路上皮移行细胞癌的产品，它的应用方法为(a)、组织分离，手术切除待检的尿路上皮组织，分离后，迅速提取病灶及周围5cm以外正常组织，放入液氮保存，逆转录酶为M-MLV Reverse Transcriptase, Takara Co. PCR试剂TaqDNA聚合酶、dNTP， CK15角蛋白基因的引物是Forward:5’-ggaagagatccgggacaaa-3’Reverse:5’-tgtcaatctccaggacaacg-3’，PCR产物长度为456 bp，以β-actin作为内参对照，其引物Forward:5’-agccatgtacgtagccatcc-3’Reverse:5’-

tcacaatgcctgtggtacg-3’，β-actin扩增片断长度为400bp；

(b)、总mRNA的抽提步骤具体如下：将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理，将匀浆样品在室温放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离,每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4℃10000×g离心15分钟使样品分为三层：将上层无色水相转如离心管，用异丙醇沉淀水相中的RNA；每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟；用75℅乙醇洗涤RNA沉淀，每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇，2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清；室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25-200μl无Rnase水,55-60℃放置10分钟使RNA溶解；-70℃保存，为除去基因组DNA污染，全部RNA均用无RNA酶的DNA酶I消化；

(c)、使用Biometra公司的实时荧光定量PCR仪，检测CK15角蛋白基因在人类尿路上皮移行细胞癌组织及其对应正常组织中的表达，反应体系如下：总体积20μl，SYBR Premix EX Taq 10μl，引物各0.2μl，DNA 1μl，ddH2O 8.2μl，离心混匀，放入PCR仪中反应，以β-actin为内参，实验数据用REST2009软件分析,P<0.05定义为有统计学意义，CK15角蛋白在人类尿路上皮移行细胞癌组织显著上调。